1、液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么？
①筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。
②存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子
③可能柱超载，减少进样量。
2、HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法是什么？
①样品量不足，解决办法为增加样品量
②样品未从柱子中流出。可根据样品的化学性质改变流动相或柱子
③样品与检测器不匹配。根据样品化学性质调整波长或改换检测器
④检测器衰减太多。调整衰减即可。
⑤检测器时间常数太大。解决办法为降低时间参数
⑥检测器池窗污染。解决办法为清洗池窗。
⑦检测池中有气泡。解决办法为排气。
⑧记录仪测压范围不当。调整电压范围即可。
⑨流动相流量不合适。调整流速即可。
⑩检测器与记录仪超出校正曲线。解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。
3、做HPLC分析时，柱压不稳定，原因何在？如何解决？
①泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理；
②比例阀失效，更换比例阀即可；
③泵密封垫损坏，更换密封垫即可；
④溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法；
⑤系统检漏，找出漏点，密封即可；
⑥梯度洗脱，这时压力波动是正常的。
4、我购买的HPLC柱验收测试时柱压过高，请问为什么？
柱压过高是HPLC柱用户最常碰到的问题。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的问题，您可按下面步骤检查问题的起因。
①拆去保护预柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查；
②把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若压力下降，再检查；
③将柱子的进出口反过来接在仪器上，用10倍柱体积的流动相冲洗柱子，（此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动池）。这时，如果柱压仍不下降，再检查；只用于使用过的柱子。
④更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明您的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。若柱压还高，请与厂商联系。一般情况下，在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器便可避免柱压过高的问题。
5、色谱柱中的流动相会排干吗？
不少做色谱分离试验的人遇到过这样的情形：不慎未及时补充流动相，泵将溶剂瓶中的流动相吸干了，HPLC系统由此而停止工作了。如此情况是否会损坏色谱柱？泵是否已将色谱柱中所有流动相都排干了？色谱柱还能使用吗？事实上，如果泵将溶剂瓶中的流动相吸干，并不会造成色谱柱的损坏。即使泵中充满了空气，泵也不会将空气排入色谱柱。因为泵只能输送液体，而不能输送空气。
相比之下，另一个更可能发生的情况是忘记盖上色谱柱两端的密封盖或盖子太松而使色谱柱变干。同样，整个色谱柱干涸的情况不太容易发生，多半可能只是色谱柱两端的几个毫米变干了，因挥发掉所有溶剂是色谱柱变干需要相当长的时间。即使色谱柱真的变干了，也不一定就不可救药了。可以尝试用一种完全脱气的、表面张力低的溶剂（如经氦气脱气的甲醇）冲洗色谱柱以除去气体。较低的表面张力有助于浸润填料表面；已脱气的溶剂应该能够溶解并去除滞留在填料中的气体。色谱柱大约需要（以1mL/min的流速）冲一个小时或更多的时间被彻底浸润，恢复到正常状态。
6、为何出现峰展宽？
①样品体积过大--用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%
②在进样阀中造成峰扩展--进样前后排出气泡以降低扩散
③数据系统采样速率太慢--设定速率应是每峰大于10点
④检测器时间常数过大--设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%
⑤流动相粘度过高--增加柱温,采用低粘度流动相
⑥检测池体积过大--用小体积池,卸下热交换器
⑦保留时间过长--等度洗脱时增加强溶剂含量,也可用梯度洗脱
⑧柱外体积过大--将连接管径和连接管长度降至最小
⑨样品过载--进小浓度小体积样品
7、除了在线脱气，常用的实验室脱气方式还有哪些？
加热回流脱气，脱气效果较佳，但无法保持；氦脱气，此方法脱气效果佳，能除去百分之九十以上的空气，但氦气价格太贵，所以用的不多；真空脱气，效果仅次于氦脱气，但脱气过程中容易造成样品溶液挥发损失；超声脱气，只能脱去约百分之三十的空气，但在实验室中常用。目前还是尽量争取用在线脱气，方便且效果好。
8、如何简单判断比例阀是否内漏？
设定泵使用一个单独通路（A），打开Purge阀，流速5ml/min，提起其他溶剂瓶内的溶剂过滤头直至离开液面，观察这些通路（B、C、D）内的溶剂是否随着流动，正常时均不应流动。
反相高效液相色谱柱是基于溶质、极性流动相和非极性固定相表面间的疏水效应建立的一种色谱模式，任何一种有机分子的结构中都有非极性的疏水部分，这部分越大，一般保留值越高。
在高效液相色谱中这是应用面较广的一种分离模式，在生物大分子的反相液相色谱条件下，流动相多采用酸性的、低离子强度的水溶液，并加一定比例的能与水互溶的异丙醇、乙腈或甲醇等有机改性剂，大量使用的填料为孔径在30纳米以上的硅胶烷基键合相，除此之外，也有少量高聚物微球。
反相高效液相色谱柱的使用和维护
在色谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱。
(1)柱子在装卸、更换时，动作要轻，接头拧紧要适度。必须防止较强的机械振动，以免柱床产生空隙。
(2)如果仪器用来做常规分析，样品种类有限，但分析次数多，则不妨为每一类常规分析配置一根专用柱，这样有助于延长柱子的寿命。
(3)避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。
温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓。
(4)应逐
渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。
(5)如使用柱温控制装置时，应注意在通人流动相后才能升温。
(6)一般说来反相高效液相色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。
(7)选择使用适宜的流动相，以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一个预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶“饱和”，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。
(8)避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注人柱内，需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一个保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱。保护柱可以而且应该经常更换。
(9)经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右，即常规分析需要50-75mL。
(10)保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。
(11)反相高效液相色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进人柱内，使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。
(12)在完成分离分析工作之后，不应立即停机，需及时对色谱分析系统进行冲洗，一般0.5h以上，以除去色谱柱内的杂质。
在日常分离分析工作中，反相高效液相色谱柱的正确使用和维护十分重要，色谱柱使用是否得当，直接影响色谱柱的寿命，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。
高效液相色谱仪可以完成二元高压梯度洗脱，也可以拓展为制备系统，采用高压混合器连接两个高压恒流泵，利用RS232通讯，即可实现梯度分析；
便于用户自由选择与搭配，混合器材主要由不锈钢、生物惰性PEEK等构成，用途广泛；
可广泛应用于研究开发、医药检验、食品检测、化工分析、环境监测等众多分析领域。
高效液相色谱仪分离原理：液-液分配(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化学键合相色谱(Chemically Bonded Phase Chromatography) 流动相和固定相都是液体。
流动相与固定相之间应互不相溶（极性不同，避免固定液流失），有一个明显的分界面。
当试样进入色谱柱，溶质在两相间进行分配。达到平衡时，高效液相色谱仪报价，服从于高效液相色谱计算公式；
6种定量计算方法：归一法、修正归一法、带比例因子的修正归一法、内标法、外标法，高效液相色谱仪适用范围，以及指数计算法。
高效液相色谱仪特点：
1、梯度洗脱内部软件可自控制，编辑、存贮60个梯度方法，运行复杂的梯度程序；
2、泵形式：串联双柱塞 浮动式密封圈；泵头自冲洗功能，泵无须手动排空即可输液“自吸式单向阀”技术，可延长密封圈使用寿命；
3、光路系统采用精密定位结构和独特的散热技术，高效的光学系统和数字过滤；
4、程序化的溶剂类和压缩因子，可自动补偿；完整的预清洗功能，更于快速溶剂更换；
5、波长调节功能：既可由键盘面板控制也可由程序软件设定，全封闭集成型光电检测元件，无需任何机械部分调整即可选择或改变波长；
6、光源运行时间在线监测并显示，方便用户确定光源寿命；
7、三条流量校正曲线以及特有的多点参数校正，保障了极高的流量准确性；
8、梯度：高压2-3元；梯度方式：高压，梯度洗脱内部软件可自控制，可通过PC机及泵控制；
9、实时显示样品池和参比池能量，方便判断光源和流通池状态；
10、紫外检测器具有自动波长定位调整，自动调零，多量程输出选择；
11、智能化高，可实现网络化平台监控，提高了你的QC效益；
12、自动化，让你从繁锁的分析操作中解放出更多的时间。
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