液相色谱柱、特别是高效液相色谱柱的填装，需要有较高的技巧和熟练的技能。因此，有人甚至将“装柱”看作是“艺术加技术”。但是，只要掌握了一些基本的规律和方法，任何实验室都可以填装出具有较高柱性能的色谱柱。当然，目前大多数实验室多是购买商品预填装柱来满足分离、分析之需。但是在一些有特殊需要的情况下，或为节省经费，在实验室中自行填装高效液相色谱柱还是可取的。
液相色谱柱填装程序中应该注意的问题：
①高压操作的安全问题。常发生的问题是柱子与匀浆罐连接不牢，造成加压时柱头被高压冲下或柱子从匀浆罐上滑脱。此时，轻则填装失败，材料损失，重则造成人身伤害事故，一定要加以防范。除每次填装前均须仔细确认是否连接正确且牢靠外，可以还可加上由法兰盘和长螺杆组成的预防脱落装置，以防万一。
②通常，先填装的柱床较后填装的柱床紧密。因此，当使用时宜以相反的方向为宜，即让近匀浆罐一端作为使用时流动相的出口，而填装时的出口端则作为流动相的入口。
③新柱子使用前应以甲醇冲洗20-30min, 后，再改用流动相平衡。
④新柱子宜选适宜的标准样品进行评价并记录，以备存查和比较。
色谱柱在使用前，可以进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。在做柱性能测试时要按照色谱柱出厂报告中的条件进行（出厂测试所使用的条件是较佳条件），只有这样，测得的结果才有可比性。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同。
1、样品的前处理；
a、可以使用流动相溶解样品；
b、使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质；
c、使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。
2、流动相的配制
液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：
a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中（或长期留在柱中）；
b、流动相与样品不产生化学反应；
c、流动相的黏度要尽量小，以便得到好的分离效果；降低柱压降，延长泵的使用寿命（可运用提高温度的方法降低流动相的黏度）；
d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，可以使用对紫外吸收较低的溶剂配制；
e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行；
f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。
3、流动相流速的选择
因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求较佳柱效，可以使用较佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1ml/min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml/min为佳。
当选用较佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间（如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量）。
注意：
a.含水流动相可以在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。可以加入叠氮化钠，防止细菌生长；
b.流动相要求使用0.45μm滤膜过滤，除去微粒杂质；
c.使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能。
1.对于一根常用的C18柱，拿到一根新柱的时候应该怎样进行活化及维护?为什么要这样做?
答：新柱活化，实际上是一个平衡的过程，除了用流动相平衡外，有时候还必须用所测样品对新柱进行平衡，特别是测定分子量比较高的多肽，尤其重要。因为分子量高的物质分子，扩散速度慢，平衡所需时间也相应较长。具体平衡方式也很简单，多进几次样品，直到峰面积和保留时间稳定，再进行正式进样测定。
如果要加快平衡时间，把前面用来平衡的进样样品浓度加大，或者不等洗脱完成，连续进样多针。用待测物对新柱平衡，目的是将硅胶基质填料表面具有非特异性吸附的位点的吸附能力饱和掉。
2.测定多肽，一般采用什么柱子?流动相是乙腈和水，还有微量的TFA。特别是像类似三肽的短肽，应该怎么选择柱子?
答：分子量不高的多肽一般选用常规C18柱就能测定，也有用离子交换柱、水性C18柱和Hilic亲水作用柱的。
3.氨基柱在进酸性样品时，很伤柱子，如使用一段时间后，柱效降低，峰形改变，如何恢复?
答：氨基柱测酸性样品，应该是用氨基柱的HILIC模式。酸的存在可能会使略带负电荷的氨基官能团质子化，导致使用一段时间后对于某些类的分析物保留性质有所改变或表现在柱效下降。
建议：用5-10倍的柱体积的含0.5-1.0%NH3的乙腈-水(50:50)溶液冲洗该柱(冲洗后当然要再用不含碱的流动相洗去多余氨)，之后再进行分析这类酸性分析物时建议在流动相中略微添加少许氨如0.1%。
4.色谱柱的技术都有哪些?比如封尾等，这些技术在应用时都体现在哪里?
答：色谱柱技术包括填料技术和装柱技术，填料技术自不待言，填料的好坏对色谱柱分离性能和选择性有决定性影响。装柱技术也没有想象中的这么简单，不同固定相、不同粒径、不同柱管内径和长度，装柱工艺都有所不同，要装出紧密、稳定、均一的柱床，更多是一门艺术，需要经验积累。
国内和国外相比，我认为色谱柱的差距在于：国内公司以前都不会自己开发填料，一般买国外现成填料装柱，买到的填料质量控制权不在自己手里。另外因为装柱历史短，经验积累少，装柱工艺也没有完全达到国外水平。另外，对色谱柱性能很关键的基础材料-----裸硅胶，国产的还不过关，在纯度、粒径和孔径的均一性方面和国外产品相比，差距很大。
5.色谱柱技术的差距在哪里?
答：液相色谱柱装填实际上是有一定技巧和程序，可能还有一些运气。一般使用高压匀浆方法装填。也就是能让填料在溶剂内均匀地悬浮。然后用瞬间高压压实，这实际上用到了不同比例的匀浆液体，和合适的压力。压力太大，颗粒破碎，压力太小，塔板数少。同时压力需要稳定，不然分布不均，拖尾严重。同时还有头上平整程度。套上套，就可以用了。
6.柱子在什么情况下可以清洗一下筛板呢?原来也讨论过这个问题，我也拆下来清洗过，但我看到柱前段的污染更甚，于是就用刀片刮了刮，然后把清洗好的筛板安装上去。问题解决了，但使用寿命会不会减少呢?
答：柱头污染了，就取出污染的，再装一些填料。因为加入你刮了些填料，那么微观的塔板数就少了。假入你刮得不多，仅表面，可能就是一些脏物，所以，问题解决。但是今后还会有同样问题，再挂，那么不小心刮，影响柱效。建议还是装一个预柱。
7.如果柱子取下来放置一段时间，需要做什么保护吗?
答：对一般的反相柱，也就是洗干净后放到纯甲醇(乙腈)或者是80%左右的甲醇(乙腈)水中，然后用堵头塞紧柱两头，以免保存溶剂挥发，应该不需要做特殊的保护。
8.流动相中加入适量的四氢呋喃可以改善峰形的机理是什么?
答：《高效液相色谱方法及应用》于世林编著的上面说：甲醇为质子给予体、乙腈为质子接受体、四氢呋喃是偶极溶剂，应该除了极性影响，还有另外的影响因素，至于分离机理，还是比较复杂的，不能看成是个万能方法。
9.关于色谱柱的填装问题!我个人认为现在色谱柱的填装一般有3种情况：
(1)国外生产填料并填装完成成品卖到国内;
(2)国外生产填料，国内填装销售;
(3)国内生产填料，国内填装销售。
一般情况下，第1种情况卖的比较贵，也质量可以!可是我就不明白了：如果是填料的生产很复杂的话，那么填装上国内也跟不上去吗?为什么换在国内填装就会出现或多或少的一些小问题呢?
答：国内填装会出现质量小问题，和国内目前普遍做事没有国外严谨有关吧。如果工艺技术上没有问题，又能制订并切实执行一整套严格的生产质量管理措施，国内填装和国外填装并无区别。
10.国产色谱柱在市场上占有比例如何啊?
答：国内色谱柱市场还没有人进行过科学统计，连一年色谱柱销售总量也众说纷云，更别说国内生产色谱柱所占份额了。我估计是占30%左右吧。
11.预柱或保护柱用还是不用的问题!原来分析中药品种时，我一直都是用保护柱。但来到新公司后，发现大家都没有使用，几个实验室连保护柱都没找到一个，也就是说大家从来都没有用过。后来问一个老员工，说是有可能影响药品分析。我就想问：安装保护柱后会影响样品分析吗?我们做的大多是头孢类的抗生素。
答：应该这样说，加上保护柱，肯定有利于保护色谱柱不受一些颗粒物质的堵塞，肯定有害于分离度和柱效，因为保护柱中间有着死体积的存在。但是如果保护柱接得好，并且尽量控制其匹配性和经常更换，分离度和柱效应该影响并不大。
头孢类的抗生素也要看到底是原料药还是制剂喽，有些原料药，可以根据色谱柱的损耗选择添加预柱(中间是个筛板)，制剂的话，如果有辅料严重干扰或者流动相盐分比较大，那还是可以配个保护柱。
12.用的是四元梯度泵A50%甲醇B50%水经常出现停或进气泡这是什么原因?
答：水/甲醇比例在55：45时，黏度和柱压有个极大值。50：50接近了这个极值，柱压是比较高的，但影响柱压最大的还是填料粒径和色谱柱内径，你这个实例中不知用的什么规格的色谱柱?系统压力高，可能会因溶剂泵中的过滤头供液速度跟不上而导致气泡进入系统，停机也应该是因为气泡进入压力下降的原因，可考虑更换液体通量更大的过滤头。
13.柱填充的技术性很强，大多数实验室使用已填充好的商品柱。为什么以20um为分界点?填料方法的前三种都是湿法吗，能不能对四种填充方法做一个简短的说明?
答：资料显示：在正常条件下，填料粒度>20?m时，干法填充制备柱较为合适;颗粒<20?m时，湿法填充较为理想。填充方法一般有4种
①高压匀浆法，多用于分析柱和小规模制备柱的填充;
②径向加压法，Waters专利;
③轴向加压法，主要用于装填大直径柱;
④干法。
14.想请您具体说明一下反冲色谱柱的方法，是不连检测器吗?
答：反冲就是将柱子反向连到系统中。因为有污染物反冲出来，当然不连检测器，出液端直接接到废液瓶就可以。
15.网上对柱子是否可以反冲一直有争论，那什么样的柱子可以反冲，什么不可以。反冲后是正者用，还是反着用。具体到各型号柱子不仅是ODS柱，其他如正向柱、氨基柱、离子交换柱等可以都有解释。
答：一般的正相反相柱应该都能反冲，只有两端筛板孔径不对称的柱子不能反冲，不过目前这样的柱子已经比较少见了。反冲是为了把柱头的污染物冲洗掉，反冲后还是正着用比较好，以免柱子的两头都被污染。我们一直提倡的是：正向使用，反向冲洗。
16.我在做方法开发的时候,用乙腈和水作为流动相,在调整梯度的时候发现,刚开始用60%乙腈,RT为2.5分钟,调到40%乙腈,RT没有变化,30%也没有变化,一直调到20%的时候,RT突然变到了约13分钟,请问这是什么原因?我用的是离子交换柱。
答：离子交换柱的保留时间主要由洗脱液的离子强度和pH决定，你现在讲的比较简单，需要把你的方法说的详细一点才能做具体的分析。譬如分析物是什么情况，其含有极性电离基团和非极性基团是什么性质?离子交换柱是聚合物基质还是硅胶基质?水相是什么缓冲盐?
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