紫外分光光度计应用范围包括市政和工业废水,饮用水,加工过程用水,地表水,冷却水和锅炉补给水等。
是实验室普及率最高的一种光谱仪器了,由于灵敏度高、选择性好、准确度高、适用浓度范围广,重要是分析成本低、操作简便、快速得到广泛的应用,长期在分析领域扮演很重要的角色。但是常常会听某些同学为啥时候更换光源而烦恼,每次数据有差别,都觉得是光源惹得祸。
紫外分光光度计信号部分:
(1)紫外分光光度计样品信号重现性不良;
原因:排除仪器本身的原因外,最大的可能是样品溶液不均匀所致;在简易的单光束仪器中,样品池架一般为推拉式的,有时重复推拉不在同一个位置上;
检查:更换一种稳定的试样判定;
解决办法:采取正确的试样配置手段;修理推拉式样品架的定位碰珠;
(2)紫外分光光度计做基线扫描或样品扫描时,基线或信号有一个大的负脉冲;
原因:扫描速度设置得过快,信号在读取时,误将滤光片或光源镜的切换当做信号读取了;
检查:改变扫描速度;
(3)紫外分光光度计做基线扫描或样品扫描时,基线或信号有一个长时间段的负值或满屏大噪声;
原因:滤光片饲服电机“失步”,造成档位错位,国产电机尤甚;
检查:重新开机有可能回复,或打开单色器对照波长与滤光片的相对位置来检查(注意:打开单色器时要保护检测器不被强光刺激);
解决办法:更换饲服电机;
(4)紫外分光光度计样品出峰位置不对;
原因:波长传动机构产生位移;
检查:通过氘灯的656.1nm的特征谱线来判断波长是否准确;
解决办法:对于高档仪器而言处理手段相对简单,使用仪器固有的自动校正功能即可;而对于相对简单的仪器,这种调整则需要专业人员来进行了;
(5)紫外分光光度计信号的分辨率不够,具体表现是:本应叠加在某一大峰上的小峰无法观察到;
原因:狭缝设置过窄而扫描速度过快,造成检测器响应速度跟不上,从而失去应测到的信号;按常理,一定的狭缝宽度要对应一定范围的扫描速度;或者狭缝设置得过宽,使仪器的分辨率下降,将小峰融合在大峰里了。
检查:放慢扫描速度看一看或将狭缝设窄;
解决办法:将扫描速度、狭缝宽窄、时间常数三者拟合成一个优化的条件;
(6)当紫外分光光度计波长固定在某个波长下时,吸光值信号上下摆动,特别是测量模式转换为按键开关式的简易仪器;
原因:开关触点因长期氧化所致造成接触不良;
检查:用手加重力量按琴键时,吸光值随之变化;
解决办法:用金属活化剂清洗按键触点即可;
紫外分光光度计是实验室普及率很高的一种光谱仪器,由于灵敏度高、选择性好、准确度高、适用浓度范围广,而且分析成本低、操作简便、快速得到广泛的应用,长期在分析领域扮演很重要的角色。
在选择这类仪器时要考虑哪些因素呢?
1、光学构造(OPTICALCONFIGURATION)
一般来说,紫外光分光光度计分为单光束和双光束两类。顾名思义,单光束型主要是依赖单束光进行测量。一束给定波长的光通过对照物,然后再通过实际样品溶液,就能得到吸光结果。
双光束型则是通过一个斩光轮(mirroredchopperwheel)将一束光分成两束,分别测量对照样品和实际样品。
可以最小化光漂移(lampdrift)和减少测量时间。一些双光型光度计不利用斩光轮,而是利用一种光束分光器来代替,将一束光分成两束平行的光然后同时测量对照样品和目的样品。
因为增加了测量的速度,所以双光束分光光度计在测量一些溶液随时间动态变化的研究中大有用处。
2、光源和检测方法(LIGHTSOURCESANDDETECTION)
分光光度计的光谱也是需要考虑的一个重要因素。实验室研究人员希望省钱购入专门仪器定量核酸、蛋白或者细菌的生长情况。
例如AmershamBiosciencesofPiscataway公司的GeneQuantII能在230、260、280、320、595和600nm的波长下测量样品。果果需要更大的灵活性,研究者可以考虑一种更高性能的宽光谱仪器,可以程序性地进行ELISAs分析和比色分析。
紫外分光光度计一般覆盖190nm和380nm波长,通常利用氘灯照明。一些特殊的仪器可以提供满足光子学和半导体研究需要的光谱范围。
VarianofPaloAlto公司的CaryDeepUV和HitachiHighTechnologiesofTokyo的U-7000AutomatedVacuumUVSystem就是这样的仪器。
一些仪器具有多种光源供选择:
紫外光、可见光和甚至红外光(780nm至3,000nm)。钨灯和卤素灯一般只覆盖可见光部分(大约380nm到800nm)。而氙灯则可以覆盖紫外光和可见光区域。
分光光度计的带宽(bandwidth)很大程度上依赖于单色仪的狭缝的宽度。可以投射出实验精确要求的光谱。
一种严格带宽使得仪器能对复杂的混合物进行高分辨率的吸光测量。可变的单色仪的狭缝宽度能使一台分光光度计满足多种实验需要。
为了测量吸光值,分光光度计制造商通常使用光电倍增管(photo-multipliertubes,PMTs)和光敏二极管。
PMTs提供快速的反应时间和良好的灵敏度,并且可以在紫外光谱调节至特定的范围。但一些制造商依赖于光敏二极管的动态范围在数秒内行使所有的光谱测量。
3、样品类型(SAMPLEFORMAT)
在大部分的样品类型中,分光光度计可接受样品孔、小玻璃管cuvette、吸浆管和微孔板。微孔板主要是满足高通量的需要和大规模的实验室需求。
但尽管对于小实验室来说,制造商仍然提供了多种容器转换器来满足通量的要求和减少实验时间。
用小试管cuvette装样品容量一般从1μl-5ml,并且一些仪器装备了各种样品固定物来满足各种改变需要。体现了柔韧性。
4、数据管理(DATAMANAGEMENT)
大部分单机型的分光光度计包含了驱动仪器运行和管理数据的软件。高性能的仪器,通常与PC机一起联用,需要从制造商提供额外的软件。同时用户也可以选择升级软件以满足他们的需要。
另外一个值得考虑的因素是数据的最终使用。各独立实验室都有各自感兴趣的实验结果。
例如一些药物机构需要考虑美国FDA的要求和欧联盟的药物评价机构的要求选择不同的数据处理方式。
紫外可见光谱仪涉及的波长范围在有机化学研究中得到广泛的应用。通常用作物质鉴定、纯度检查,有机分子结构的研究。
在定量方面,可测定结构比较复杂的化合物和混合物中各组分的含量,也可以测定物质的离解常数,络合物的稳定常数,物质分子量鉴别和微量滴定中指示终点以及在高效液相色谱中作检测器等。
基本工作原理:
紫外分光光度计基本工作原理和红外光谱仪相似,利用一定频率的紫外可见光照射被分析的有机物质,引起分子中价电子的跃迁,它将有选择地被吸收。
一组吸收随波长而变化的光谱,反映了试样的特征。在紫外可见光的范围内,对于一个特定的波长,吸收的程度正比于试样中该成分的浓度,因此测量光谱可以进行定性分析,而且根据吸收与已知浓度的标样的比较,还能进行定量分析。
分光光度计的使用方法:
(1)接通电源;(2)使用前预热15min;(3)选择波长;(4)选择检测器;(5)如果可能的话,选择正确的缝宽;
(6)插入适当的空白对照;(7)调解到0%的透过率;(8)将吸光值调到零;(9)分析样品;(10)每测量10个样品后,用空白对照校验零刻度;(11)检测仪器的可重复性。
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