分光光度法是根据被测物质分子对紫外、可见波段范围单色辐射的吸收或反射强度来进行物质的定性、定量或结构分析的一种方法。
可见分光光度计的维护:
1、保护光源:光源灯有一定的寿命,仪器不工作时不要开灯,若工作间歇时间短,可不关灯。 一旦停机,则要待灯冷却后再重新启动,并预热15min。
灯泡发黑或亮度明显减弱或不稳定时,就及时更换。 经经紫外光照射后形成结痕可用无水乙醇去除。
2、保证合适的工作环境温度和湿度是影响仪器性能的重要因素。
不适宜的温度和湿度可引起机械部件的锈蚀,使金属镜面的光洁度下降,引起仪器机械部分的误差或性能下降;造成光栅、反射镜、聚焦镜等光学部件的铝膜锈蚀,产生光能不足、杂散光、噪声等;甚至使仪器停止工作,从而影响仪器寿命。维护保养时应定期加以校正温度和湿度。
3、定期清洁,保障环境和仪器内卫生条件,防尘。
仪器使用一定时间后,内部会积累一定量的尘埃,可以由维修工程师或在工程师指导下定期开启仪器外罩对内部进行除尘工作,同时将各发热元件的散热器重新紧固,对光学盒的密封窗口进行清洁,必要时对光路进行校准,对机械部分进行清洁和必要的润滑,最后恢复原状,再进行一些必要的检测、调校和记录。
4、正确使用比色皿拿比色皿时,手指只能捏住比色皿的毛玻璃面,不要碰比色皿的透光面,以免沾污。
清洗比色皿时,先用水冲洗,再用蒸馏水洗净。若被比色皿被有机物沾污,可用盐酸-乙醇混合洗涤液(1:2)浸泡片刻,再用水冲洗。
每次做完实验应立即洗净比色皿。比色皿外壁的水用擦镜纸或细软的吸水纸吸干,以保护透光面。
可见分光光度计是一种结构简洁、使用方便的单光束分光光度计,基于样品对单色光的选择吸收特性可用于对样品进行定性和定量分析。
广泛应用于医药卫生、临床检测、生物化学、石油化工、环保监测、食品生产和质量控制等部门作定性、定量分析,还可作为大、专院校和中学相关课程的教学演示和实验仪器。
紫外可见吸收光谱是由于分子中的某些基团吸收了紫外可见辐射光后,发生了电子能级跃迁而产生的吸收光谱。
由于各种物质具有各自不同的分子、原子和不同的分子空间结构,其吸收光能量的情况也就不会相同;
因此,每种物质就有其特有的、固定的吸收光谱曲线,可根据吸收光谱上的某些特征波长处的吸光度的高低判别或测定该物质的含量,这就是分光光度定性和定量分析的基础。
分光光度分析就是根据物质的吸收光谱研究物质的成分、结构和物质间相互作用的有效手段。它是带状光谱,反映了分子中某些基团的信息。可以用标准光图谱再结合其它手段进行定性分析。
根据Lambert-Beer定律说明光的吸收与吸收层厚度成正比,比耳定律说明光的吸收与溶液浓度成正比;如果同时考虑吸收层厚度和溶液浓度对光吸收率的影响,即得朗伯-比耳定律。
即A=εbc,(A为吸光度,ε为摩尔吸光系数,b为液池厚度,c为溶液浓度)就可以对溶液进行定量分析。
将分析样品和标准样品以相同浓度配制在同一溶剂中,在同一条件下分别测定紫外可见吸收光谱。
若两者是同一物质,则两者的光谱图应完全一致。如果没有标样,也可以和现成的标准谱图对照进行比较。这种方法要求仪器准确,精密度高,且测定条件要相同。
实验证明,不同的极性溶剂产生氢键的强度也不同,这可以利用紫外光谱来判断化合物在不同溶剂中氢键强度,以确定选择哪一种溶剂。
应用:
在水和废水监测中的应用,对于一个水系的监测分析和综合评价,一般包括水相(溶液本身)、固相(悬浮物、底质)、生物相(水生生物)。
在水质的常规监测中,紫外可见分光光度法占有较大的比重。由于水和废水的成分复杂多变,待测物的浓度和干扰物的浓度差别很大,在具体分析时必须选择好分析方法。
在农产品和食品分析中可用于检测的组分或成分有蛋白质、赖氨酸、葡萄糖、维生素C、硝酸盐、亚硝酸盐、砷、汞等;
在植物生化分析中可用于检测叶绿素、全氮和酶的活力等;
在饲料分析中可用于检测烟酸、棉酚、磷化氢和甲酯等。
在紫外分光光度计的测试指标中准确度是至关重要的,只有保证了准确度才能保证样品数据的准确性和真实性。
影响紫外可见分光光度计准确度的因素有:
(1)波长准确度。波长准确度在确保紫外可见分光光度计的准确度中起着十分重要的作用。因为测试样品物质不同,那么它对不同波长的光有着不同的摩尔吸光系数。由朗伯比尔定律可知,不同的摩尔吸光系数所对应的吸光度会有差异,由此就会产生不一致的分析误差。
(2)杂散光。杂散光是准确度分析误差的一个重要来源,直接影响着样品物质在测试时所能配制的最大浓度。有研究结果表明,越高浓度的测试样品杂散光的影响越大,如果是在一个比较大的浓度下,杂散光增强,吸光度和浓度成比例的范围缩小。
(3)噪声。影响紫外可见分光光度计光度准确度的噪声包括光噪声和电噪声。其中光噪声是由光源产生的,具体来说就是光源的发光强度分布因子导致光噪声的出现。电噪声的来源是光电倍增管、各种电源以及放大器等。作为紫外可见分光光度计光度准确度最关键的技术参数之一,噪声是分析测试中主要误差源头,它是影响紫外可见分光光度计光度准确度检测下限的因素。
(4)基线平直度。基线平直度是全波段内每个波长上的噪声体现,基线平直度直接影响紫外可见分光光度计光度准确度的灵敏度以及影响检测下限或使用范围,是紫外可见分光光度计中一个十分重要的技术参数。购买者和使用者在选购和使用紫外可见分光光度计的时候,对基线平直度会有这特别的重视程度,会作为选购和使用的重要技术指标。但是相对于其他影响紫外可见分光光度计光度准确度的因素来说,基线平直度是受到目前国内外研究工作者重视程度远远不够的技术指标。
(5)光谱带宽。光谱带宽是影响紫外可见分光光度计光度准确度的一个十分重要的因素。当光谱带宽不同时,测试得到的数据就会不同,因而不同光谱带宽下的分析误差也大相径庭。