反相高效液相色谱柱是基于溶质、极性流动相和非极性固定相表面间的疏水效应建立的一种色谱模式，任何一种有机分子的结构中都有非极性的疏水部分，这部分越大，一般保留值越高。
在高效液相色谱中这是应用面较广的一种分离模式，在生物大分子的反相液相色谱条件下，流动相多采用酸性的、低离子强度的水溶液，并加一定比例的能与水互溶的异丙醇、乙腈或甲醇等有机改性剂，大量使用的填料为孔径在30纳米以上的硅胶烷基键合相，除此之外，也有少量高聚物微球。
反相高效液相色谱柱的使用和维护
在色谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱。
(1)柱子在装卸、更换时，动作要轻，接头拧紧要适度。必须防止较强的机械振动，以免柱床产生空隙。
(2)如果仪器用来做常规分析，样品种类有限，但分析次数多，则不妨为每一类常规分析配置一根专用柱，这样有助于延长柱子的寿命。
(3)避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。
温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓。
(4)应逐
渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。
(5)如使用柱温控制装置时，应注意在通人流动相后才能升温。
(6)一般说来反相高效液相色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。
(7)选择使用适宜的流动相，以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一个预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶“饱和”，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。
(8)避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注人柱内，需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一个保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱。保护柱可以而且应该经常更换。
(9)经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右，即常规分析需要50-75mL。
(10)保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。
(11)反相高效液相色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进人柱内，使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。
(12)在完成分离分析工作之后，不应立即停机，需及时对色谱分析系统进行冲洗，一般0.5h以上，以除去色谱柱内的杂质。
在日常分离分析工作中，反相高效液相色谱柱的正确使用和维护十分重要，色谱柱使用是否得当，直接影响色谱柱的寿命，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。
色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。在色谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱。
调节流速太快
避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓（如前所述）。
反冲色谱柱
一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。
预柱和保护柱
选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶“饱和”，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。
避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱。保护柱可以而且应该经常更换。
色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝等组成。正确使用和保存有助于延长色谱柱的使用寿命。
色谱柱的取下和保存：
1)色谱柱加热使用的情况下，先把流量下降到0.2～0.3mL/min，然后，继续送液的同时慢慢的把色谱柱温度降低到室温。
2)色谱柱温度降低到室温后，先停止泵，再把色谱柱从装置中取下，拧紧两端的螺栓。
色谱柱购入时的封入液和流动相不同的情况，先用封入液置换，再取下色谱柱。要拧紧色谱柱两端的螺栓，避免漏液。
3)色谱柱放置于购入时的包装盒内，放在温度变化少的地方(恒温室比较适合)进行保存。
4)GPC、GFC色谱柱长时间保存的情况下，推荐使用液浸保存的方法。这种情况，把色谱柱的出口端从装置上取下，连接上外径1/16英寸、内径0.8mm、长50cm的特氟龙软管。然后启动泵，特氟龙软管的前端有流动相流出后停止泵，把特氟龙管的前端浸入含有80ml浸入液的容积为100ml的瓶中。把色谱柱的入口端从装置上取下，拧紧螺帽放置在温度变化少的地方保存。液浸保存的时候，色谱柱中的溶剂每个月用新的溶剂置换一下，能更长地保持色谱柱的性能。
5)3天内会再次使用的情况下，不需要把色谱柱取下进行保存。对于容易析出的盐溶液，腐蚀性的溶剂作为流动相的情况下，除了1天以内保存的情况外，都需要用流动相把盐溶液和腐蚀性溶剂置换后保存。
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