1、色谱柱的使用说明:
(1)色谱柱使用前注意事项:色谱柱的储存液无特殊说明,均为评价报告所示的流动相。在使用前,一定要注意色谱柱的储存液与要分析样品的流动相是否互溶。在反相色谱中,如用高浓度的盐或缓冲液作洗脱剂,应先用10%左右的低浓度的有机相洗脱剂过渡一下,否则缓冲液中的盐在高浓度的有机相中很容易析出,堵塞色谱柱。
(2)流动相:流动相中所使用的各种有机溶剂要尽可能使用色谱纯,配流动相的水可以是超纯水或全玻璃器皿的双蒸水。如果将所配得流动相再经过0.45μm的滤膜过滤一次则更好,尤其是含盐的流动相。另外,装流动相的容器和色谱系统中的在线过滤器等装置应该定期清洗或更换。
以常规硅胶为基质的键合相填料通常的PH值适用范围是2.0-8.0,BDSC18适合于碱性化合物,PH值适用范围为2.0-10.0。当必须要在PH值适用范围的边界条件下使用色谱柱时,每次使用结束后立即用适合于色谱柱储存并与所使用的流动相互溶的溶剂清洗,并完全置换掉原来所使用的流动相。
(3)样品:样品也要尽可能清洁,可选用样品过滤器或样品预处理柱(SPE)对样品进行预处理;若样品不便处理,要使用保护柱。在用正相色谱法分析样品时,所有的溶剂和样品应严格脱水。
2、色谱柱的保存:
(1)反相色谱柱每天实验后的保养:使用缓冲液或含盐的流动相,实验完成后应用10%的甲醇/水冲洗30分钟,洗掉色谱柱中的盐,再用甲醇冲洗30分钟。注意:不能用纯水冲洗柱子,应该在水中加入10%的甲醇,防止将填料冲塌陷。
(2)长期保存色谱柱:如色谱柱要长时间保存,必须存于合适的溶剂下。对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中,正相柱可以储存于严格脱水后的纯正己烷中,离子交换柱可以储存于水(含防腐剂叠氮化钠或柳硫汞)中,并将购买新色谱柱时附送的堵头堵上。储存的温度可以是室温。
3、色谱柱的再生:
因为色谱柱是消耗品,随着使用时间或进样次数的增加,会出现色谱峰高降低,峰宽加大或出现肩峰的现象,一般来说可能是柱效下降。
(1)反相柱的再生:依次采用20-30倍的色谱柱体积的甲醇:水=10:90(V/V),乙腈,异丙醇作为流动相冲洗色谱柱,完成后再以相反顺序冲洗色谱柱。
(2)正相柱的再生:依次以20-30倍色谱柱的体积的正己烷、异丙醇、二氯甲烷、甲醇作为流动相冲洗色谱柱,然后再以相反的顺序冲洗色谱柱。要注意上述溶剂必须严格脱水。
4、色谱柱在使用过程中易出现的问题和解决办法:
色谱柱在使用中常见的问题就是柱压升高,如果柱压是在长时间使用过程中缓慢增加,属于正常现象。但柱压在使用过程中突然升高(系统管路堵塞及压力传感器故障除外),以下列举了部分常见原因及解决办法:
(1)色谱柱头的过滤筛板堵塞或污染;
解决方法:如确定是色谱柱头的过滤筛板被污染,可以将色谱柱反方向用甲醇冲洗至正常压力,或者卸下色谱柱头,将其放在10%的稀硝酸内超声清洗10分钟,后再用纯水超声10分钟,重新装入色谱柱。
(2)色谱柱头的填料被样品污染;
解决方法:如确定色谱柱头的填料被污染,将柱头螺丝卸下,挖出柱内前段被污染的填料,用相同的柱填料重新填入,仔细修复后,重新安装上柱头螺丝。
(3)色谱柱内缓冲液中的盐遇到高浓度的甲醇或其他有机溶剂,形成结晶析出;解决方法:如确定定是盐结晶,用10%的甲醇/水冲洗色谱柱使柱内盐全部溶解,再换高浓度甲醇。
(4)流动相PH值过大或过小使固定相结构破坏或溶解。解决方法:如果因PH值使用不当,很难恢复
通常影响色谱柱使用寿命的主要因素有以下几点。
①色谱柱破损
石英毛细管柱的聚酰亚胺层,如有少许破损就很难再保护脆弱的石英毛细管。当柱箱连续地加热和冷却、柱箱风扇的震动和柱架等都会对毛细管造成应力,最终在色谱柱有弱点处破裂。大内径柱更容易破裂,也就是说,在操作0.45~0.53mm内径柱时,要比0.18~0.32mm内径柱更要小心。
如果已经断裂的色谱柱,仍在高温下连续运行或是作多阶温度程序运行,很可能损坏色谱柱,因破裂的后半段暴露在高温的氧气中,这样会很快地破坏固定相;而断裂的前半段,由于有载气流过,氧的影响会小些。如断裂的色谱柱没有再加热或只暴露在高温或空气中很短时间,断裂的后半部分不会受到明显损坏,可考虑作为它用。
②热损伤
超过色谱柱温度上限,会造成色谱柱固定相和管表面加速损坏,色谱柱的过量流失会使活性组分拖尾,降低柱效。一般热损坏是一个很慢的过程,但有氧存在时,会大大加速热损坏。另外在有漏气情况下,色谱柱过热也会加速损坏或永久性损坏色谱柱。
③氧损伤
氧是毛细管柱的大敌,在接近室温下,不会对色谱柱有太大损害,柱温升高时会严重损坏色谱柱。对于极性固定相,即使温度和氧浓度很低时,也会发生严重损坏。虽然,短时间地暴露在空气中,如注射空气或更换隔垫不会有太大问题,但也应避免。
在气路上有漏气的地方(如气路、接头和进样器),往往是进入氧气的源头,当色谱柱加热时,就会很快地损坏固定相,会过早地引起固定液的过度流失,至使活性化合物有拖尾,降低柱效。在不太严重的情况下,色谱柱还会有一定的分离功能,但柱效已经下降。在严重的情况下,色谱柱就会完全失效。
④化学损伤
有少数化合物会使固定相遭到破坏。不挥发性化合物,进入色谱柱常常会降低色谱柱的性能,但是不会破坏固定相,有条件时这些沉积的残留物可以用溶剂冲洗而除去,能恢复色谱柱的性能。
要避免进入色谱柱的主要化合物是无机和矿物碱和酸,这些矿物碱和酸不会挥发,通常积累在色谱柱的前端,如果使其停留在那里就会破坏固定相,使色谱柱过早的大量流失,使活性化合物拖尾,以及使柱效下降,其征兆和热损坏及氧损坏类似。
由于化学损坏多发生在色谱柱的前端,所以可把色谱柱的前端切掉0.5~1m,在比较严重的情况下,可以截去5m或更长的一段。如果使用保护柱就会减小色谱柱被损害的长度,但是需要经常处理或更换保护柱。酸或碱还常常会破坏石英管内的去活表面,因而会引起活性化合物的峰形变坏。
⑤污染
气相色谱中,毛细管色谱柱被污染是很普遍的问题,不幸的是,它和各种各样常见的故障相似,常常被错误的判断为其它的故障,虽然被污染了的色谱柱并没有损坏,但已失去效能。通常有两种基本类型的污染物,不挥发性污染物和半挥发性污染物。不挥发性污染残留物不能从色谱柱里洗脱出来,而是累计在色谱柱里,这样它就成为涂渍了残留物的色谱柱,因而影响溶质的分配。而且残留物还会和活性化合物相互作用,甚至造成峰的拖尾,减少峰面积。
活性溶质是指那些含有羟基或氨基(一些硫醇基)及醛的物质;半挥发性污染物最后会洗脱出去,但需要几个小时或几天时间,半挥发性污染物和不挥发性残留物一样,他们也会引起峰形变坏和峰面积减小。此外,还常常引起基线不稳定(漂移、噪音增加)或出鬼峰等。
污染物的来源有许多,其中进样是最主要的来源。生物液体和组织、土壤、废水、地下水和类似的含有大量半挥发的和不挥发物质的基体,甚至使用净化方法,样品也会含有少许这些物质并带到注射样品中,几次到几百次进样就会造成残留物的积累故障。柱上进样、不分流进样和大口径柱直接进样等进样方法常常会造成上述色谱柱的严重污染。
污染物还会来源于气体管路、净化器、密封垫、隔垫的碎屑或其他与样品可能接触的物质,如样品瓶、溶剂、注射器、移液管等,这些类型的污染物可能会突然性的引起故障。
液相色谱柱是一种用于液体色谱分析仪器,其结构主要有:
a、空柱由柱接头、柱管及滤片组装而成。
柱接头采用低死体积结构,柱接头是两端螺纹组件,一端是为7/16英寸外螺纹,另一端是3/16英寸的内螺纹(国内外已规范化)。7/16英寸外螺纹与1/4英寸柱管(Φ6.35mm)连接,中间放置压坏用于密封。3/16英寸的内螺纹与1/16英寸(Φ1.57mm)的连接管连接,中间也放置压环用于柱接头的密封。为了尽量减少柱外死体积,在安装色谱柱时,用Φ1.57mm连接管通过空心螺钉压环后要尽量插到底,然后再拧紧空心螺钉。压环被空心螺钉挤压变形后紧箍在连接管上(连接管通过压环后露出的管长度应严格控制在2.5mm长或其他固定尺寸)。
在两端柱接头内,柱管两端各放置一片不锈钢滤片(或滤网),用于封堵柱填料不被流动相冲出柱外而流失。空柱各组件均为316#不锈钢材质,能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性,故使用时要注意,柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂,以避免腐蚀。
b、柱填料:
液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的,柱子的分类是依据填料类型而定。
正相柱:多以硅胶为柱填料。根据外型可分为无定型和球型两种,其颗粒直径在3—10 ?m的范围内。另一类正相填料是硅胶表面键合—CN,-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。
反相柱:主要是以硅胶为基质,在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的非极性填料。也有无定型和球型之分。
常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、苯基等,其颗粒粒径在3—10 ?m之间。
安装方法:
a、拆开柱包装盒,确认色谱柱的类型、尺寸、出厂日期以及柱内贮存的溶剂。
b、拧下柱两端接头的密封堵头放回包装盒供备用。
c、 按柱管上标示的流动相流向,将色谱柱的入口端通过连接管与进样阀出口相连接(如条件允许,建议在柱前使用保护柱);柱的出口与检测器连接。连接管是外径为1.57mm、内径为0.1-0.3mm的不锈钢管。连接管的两端均有空心螺钉及密封用压环。在接管时一定要设法降低柱外死体积。连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力插到底,然后顺时针拧紧空心螺钉,直到拧不动为止,再用扳手继续顺时针拧1/4-1/2圈,切记不要用力过大。如色谱柱通过流动相加压后有漏液现象,请用扳手继续顺时针拧1/4圈,直至不漏液为止。