分光光度法是指应用分光光度计的分析方法，具有灵敏、准确、快速及选择性好等特点。
通常所测样品溶液浓度下限可达10-6~10-5mol/L，适用于测定食品中的微量组分（如肉制品中的亚硫酸盐、糖果中的二氧化硫等）。
原理
物质对光的选择性吸收
当光束照射到物质上时，光与物质发生相互作用，产生反射、散射、吸收或透射。
若被照射的是均匀溶液，光的散射可以忽略。
溶液颜色的产生
当一束白光通过某一有色溶液时，一些波长的光被溶液吸收，另一些波长的光则透过溶液。
透射光或反射光刺激人眼使人感到颜色的存在。
人把自身能感觉到的光定义为可见光。
在可见光区，不同波长的光呈现不同的颜色，因此溶液的颜色由透射光的波长所决定。
透射光与吸收光可组成白光，故称这两种光互为补色光，两种颜色互为补色。
光吸收的本质
当一束光照射到某物质或其溶液时，组成该物质的分子、原子或离子与光子发生“碰撞”;
光子的能量就转移到分子、原子或离子上，是这些粒子由最低能态（基态）跃迁到较高能太（激发态），这个作用称为物质对光的吸收。
被激发的粒子约在10-8s后回到基态，并以热或荧光等形式释放出能量。
分子、原子或离子具有不连续的量子化能级，仅当照射光光子的能量hυ，与被照射物质粒子的基态和激发态能量之差相当时，才能发生吸收。
不同物质微粒由于结构不同而具有不同的量子化能级，其基态和激发态能量差也不相同。
所以物质对光的吸收具有选择性。
吸收曲线
吸收曲线，也称为吸收光谱，描述了物质对不同波长的光的吸收能力。
将不同波长的光透过某一固定浓度和厚度的有色溶液，测量每一波长下有色溶液对光的吸收程度（即吸光度）；
然后以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标作图，绘制的曲线即为吸收曲线。
不同浓度的同一物质，在吸收峰附近的吸光度随着浓度增加而增大，但最大吸收波长不变。
若在最大吸收波长处测定吸光度，则灵敏度最高。
因此，吸收曲线是分光光度法中选择测定波长的重要依据。
光吸收基本定律
即朗伯-比尔定律：
当一束平行单色光通过液层厚度为b的有色溶液时，溶质吸收了光能，光的强度就要减弱。
溶液的浓度越大，通过的液层厚度越大，入射光越强，则光被吸收的越多，光强度的减弱也越显著。
该定律是紫外可见分光光度法等各类吸光光度法定量分析的依据，是由实验观察得到的，不仅适用于溶液，也适用于其他均匀非散射的吸光物质。
A=lg(I/I0)=εbc
A-吸光度；
I0-入射光强度，cd；
I-透射光强度，cd；
ε-吸光系数，L/(mol˙cm)；
b-液层厚度（光程长度），cm；
c-有色溶液的浓度，mol/L。
其物理意义为：
当一束平行单色光通过单一均匀、非散射的吸光物质溶液时，溶液的吸光度与溶液浓度和液层厚度的乘积成正比。
式中ε是吸光物质在特定波长和溶剂的情况下的一个特征常数，数值上等于浓度为1mol/L的吸光物质在1cm光程中的吸光度。
ε是吸光物质吸光能力的量度，ε值越大，方法的灵敏度越高。
由实验结果计算ε时，常以被测物质的总浓度代替吸光物质的浓度，实际上时表观摩尔吸光系数。
在多组分体系中，如果各种吸光物质之间没有相互作用，体系的总吸光度等于各组分吸光度之和，即吸光度具有加和性。
透光度T是透射光强度I与入射光强度I0之比，即：
T=I/I0
因此：A=lg(1/T)
紫外分光光度计是实验室普及率很高的一种光谱仪器，由于灵敏度高、选择性好、准确度高、适用浓度范围广，而且分析成本低、操作简便、快速得到广泛的应用，长期在分析领域扮演很重要的角色。
在选择这类仪器时要考虑哪些因素呢？
1、光学构造（OPTICALCONFIGURATION）
一般来说，紫外光分光光度计分为单光束和双光束两类。顾名思义，单光束型主要是依赖单束光进行测量。一束给定波长的光通过对照物，然后再通过实际样品溶液，就能得到吸光结果。
双光束型则是通过一个斩光轮（mirroredchopperwheel）将一束光分成两束，分别测量对照样品和实际样品。
可以最小化光漂移（lampdrift）和减少测量时间。一些双光型光度计不利用斩光轮，而是利用一种光束分光器来代替，将一束光分成两束平行的光然后同时测量对照样品和目的样品。
因为增加了测量的速度，所以双光束分光光度计在测量一些溶液随时间动态变化的研究中大有用处。
2、光源和检测方法（LIGHTSOURCESANDDETECTION）
分光光度计的光谱也是需要考虑的一个重要因素。实验室研究人员希望省钱购入专门仪器定量核酸、蛋白或者细菌的生长情况。
例如AmershamBiosciencesofPiscataway公司的GeneQuantII能在230、260、280、320、595和600nm的波长下测量样品。果果需要更大的灵活性，研究者可以考虑一种更高性能的宽光谱仪器，可以程序性地进行ELISAs分析和比色分析。
紫外分光光度计一般覆盖190nm和380nm波长，通常利用氘灯照明。一些特殊的仪器可以提供满足光子学和半导体研究需要的光谱范围。
VarianofPaloAlto公司的CaryDeepUV和HitachiHighTechnologiesofTokyo的U-7000AutomatedVacuumUVSystem就是这样的仪器。
一些仪器具有多种光源供选择：
紫外光、可见光和甚至红外光（780nm至3,000nm）。钨灯和卤素灯一般只覆盖可见光部分（大约380nm到800nm）。而氙灯则可以覆盖紫外光和可见光区域。
分光光度计的带宽（bandwidth）很大程度上依赖于单色仪的狭缝的宽度。可以投射出实验精确要求的光谱。
一种严格带宽使得仪器能对复杂的混合物进行高分辨率的吸光测量。可变的单色仪的狭缝宽度能使一台分光光度计满足多种实验需要。
为了测量吸光值，分光光度计制造商通常使用光电倍增管（photo-multipliertubes，PMTs）和光敏二极管。
PMTs提供快速的反应时间和良好的灵敏度，并且可以在紫外光谱调节至特定的范围。但一些制造商依赖于光敏二极管的动态范围在数秒内行使所有的光谱测量。
3、样品类型（SAMPLEFORMAT）
在大部分的样品类型中，分光光度计可接受样品孔、小玻璃管cuvette、吸浆管和微孔板。微孔板主要是满足高通量的需要和大规模的实验室需求。
但尽管对于小实验室来说，制造商仍然提供了多种容器转换器来满足通量的要求和减少实验时间。
用小试管cuvette装样品容量一般从1μl-5ml，并且一些仪器装备了各种样品固定物来满足各种改变需要。体现了柔韧性。
4、数据管理（DATAMANAGEMENT）
大部分单机型的分光光度计包含了驱动仪器运行和管理数据的软件。高性能的仪器，通常与PC机一起联用，需要从制造商提供额外的软件。同时用户也可以选择升级软件以满足他们的需要。
另外一个值得考虑的因素是数据的最终使用。各独立实验室都有各自感兴趣的实验结果。
例如一些药物机构需要考虑美国FDA的要求和欧联盟的药物评价机构的要求选择不同的数据处理方式。
分光光度计所采用的分光光度法在定量分析领域中的应用已有数十年的历史,至今仍是实验室中常用的分析方法之一。随着现代科学仪器的不断发展,在传统的追求准确、快速、可靠的同时,小型化、智能化、在线化、网络化成为了现代可见分光光度计新的增长点。
结构组成
分光光度计的基本组成和大多数分光光度计一样,都是由光源、单色器、比色池、光电检测器和放大器几部分组成。
1.光源
分光光度计的可见区的光源仍是采用卤素钨灯和氘灯。卤素钨灯的工作波长范围为:320～2500nm,氘灯的工作波长范围为180～375nm。两光源有仪器上的一个灯选择反射镜自动进行选择和光源切换。
1.2单色器(分光系统)
单色器是分光光度计的重要部分,比滤光片选择波长能更有效地提供带宽窄的单色光。是采用先进的光栅单色器,由入射狭缝、出口狭缝、色散元件、准直镜等光学元件组成。入射狭缝是用来调节入射单色光的纯度和强度，也直接影响分辨率。而准直镜(反射凹面镜)的作用一是将入射光束变为平行光束后再进入色散元件，二是把来自色散元件的平行光束聚焦于出口狭缝上,形成光谱像。出口狭缝是单色光的出口，它只让光谱带中所需要波长的光从狭缝中透出，而将其他波长的光挡住,不让其通过。
色散元件是单色器中的核心元件，起着将复合光分解为单色光的作用。分光光度计的色散元件是凹面反射式全息光栅,它本身就起着分解复合光和准直镜(聚焦)的作用,而且全息光栅具有杂散光小、不产生伪线和分辨率高的优点。
1.3比色池
分光光度计配有多种规格样品池架和比色杯。池架有标准池架、七位池架、50霯微量池架和多形态样品池架。比色杯有常量(2～4mL)、半微量(0.5～1mL)和微量(50～100霯),使用方便。另外还配有样品架卡套,分为特为酶动力学设计的半导体温控池:温度范围15～50℃,和流动池。
正确使用分光光度计
分光光度计操作简便。
打开仪器电源开关，仪器应顺利通过自检，然后预热10分钟左右，可以进行测定。读数时应记录最先显示的数值，不要让样品连续光照时间太长(动力学测定除外)，特别是在紫外区域测定时更要快速，因为随着光的连续照射读数会下降，变得不稳定。而应用显色剂显色后会使读数稳定，给测定带来方便，同时还会使物质中许多元素的摩尔吸光系数由原来的几万提高到数十万，明显提高了检测灵敏度。
作为一种分子吸收光谱仪,广泛应用于化学研究、生物医药、环境科学和食品分析等研究领域。它具有分析精度高、应用范围广、分析简便快速和仪器灵敏度较高的优点,是目前大多数实验室常用的定量分析仪器。
449717568