液相色谱仪系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。
储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相；
被流动相载入色谱柱（固定相）内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数；
在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别；
被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪；
数据以图谱形式打印出来高效液相色谱仪主要有进样系统、输液系统、分离系统、检测系统和数据处理系统；
下面将分别叙述其各自的组成与特点。
进样系统
一般采用隔膜注射进样器或高压进样间完成进样操作，进样量是恒定的。
这对提高分析样品的重复性是有益的。
输液系统
该系统包括高压泵、流动相贮存器和梯度仪三部分。
高压泵的一般压强为47～44X10Pa，流速可调且稳定，当高压流动相通过层析柱时；
可降低样品在柱中的扩散效应，可加快其在柱中的移动速度；
这对提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。
流动相贮存器和梯度仪，可使流动相随固定相和样品的性质而改变；
包括改变洗脱液的极性、离子强度、PH值，或改用竞争性抑制剂或变性剂等。
这就可使各种物质（即使仅有一个基团的差别或是同分异构体）都能获得有效分离。
分离系统
该系统包括色谱柱、连接管和恒温器等。
色谱柱一般长度为10～50cm（需要两根连用时，可在二者之间加一连接管）；
内径为2～5mm，由"优质不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成；
住内装有直径为5～10μm粒度的固定相（由基质和固定液构成）。
固定相中的基质是由机械强度高的树脂或硅胶构成；
它们都有惰性（如硅胶表面的硅酸基因基本已除去）、多孔性（孔径可达1000?）和比表面积大的特点；
加之其表面经过机械涂渍（与气相色谱中固定相的制备一样）；
或者用化学法偶联各种基因（如磷酸基、季胺基、羟甲基、苯基、氨基或各种长度碳链的烷基等）或配体的有机化合物。
因此，这类固定相对结构不同的物质有良好的选择性。
例如，在多孔性硅胶表面偶联豌豆凝集素（PSA）后，就可以把成纤维细胞中的一种糖蛋白分离出来。
另外，固定相基质粒小，柱床极易达到均匀、致密状态，极易降低涡流扩散效应。
基质粒度小，微孔浅，样品在微孔区内传质短。这些对缩小谱带宽度、提高分辨率是有益的。
根据柱效理论分析，基质粒度小，塔板理论数N就越大。
这也进一步证明基质粒度小，会提高分辨率的道理。
再者，高效液相色谱的恒温器可使温度从室温调到60C；
通过改善传质速度，缩短分析时间，就可增加层析柱的效率。
流动相相当于液相的血液，可以想象对液相的重要程度。那么流动相都需要注意什么呢? 01、过滤溶剂 溶剂在使用前一定要用0.5μm的过滤器过滤，如果使用固体化学试剂(缓冲盐)配制流动相，过滤特别重要，不能让固体微粒污染泵，阻塞进样器和柱头过滤片。本实验室有水溶性和脂溶性两种过滤膜供选择(反光面朝上)，过滤水溶性流动相时(如甲醇/水)，先用1～2mL甲醇润湿过滤膜，有助于快速抽滤。 02、保持储液瓶的清洁 用普通溶剂瓶作流动相储液器应不定期废弃瓶子，最后一次应用HPLC级的水或溶剂清洗，不能在清洗过程中留下污迹。 03、保证溶剂的质量 一定要用HPLC级的溶剂，水也应达到HPLC级，同样也要使用高纯度的缓冲盐。 一些因流动相引起的常见问题 01、流动相脱气不充分 流动相受热，或者流动相不同组分混合时会有气体产生，气泡进入泵内引起压力波动，增加噪音，色谱图上出现毛刺。可试用下列方法解决问题：流动相再脱气;采用更有效的脱气方法或两种方法配合使用;改系统内混合为系统外预混合。 02、流动相供给不畅 流动相用完，管道中吸入气体引起泵压力不稳。应经常观察储液器中流动相的量，加足流动相保证所有的样品分析完毕。输液管道上装沉子沉至瓶底，储液器盖上留一小孔正好夹住进液管，使其不能上下移动。 过滤器阻塞引起管道和泵腔空化，压力不稳。过滤器被微粒所阻塞或长霉，去掉过滤器后如果系统运转正常，说明已找出问题，换上新的过滤器则可。有时候换上新的过滤器仍然不畅，那就需要查查流动相的制备过程，或者换大孔径的过滤器。不管如何，流动相都需要重新过滤。 流速过高、阻力大，造成空化现象，这是由于过滤器孔径、管道内径、流速和溶剂黏度等引起的。如果流速大于10mL/min，常会出现这种现象。 使用下列方法解决： (1)使用低流速; (2)换大孔径的过滤器; (3)增加进液管道内径; (4)抬高或加压储液器; (5)不用过滤器，但流动相一定要先过滤; (6)储液器盖子太紧，在储液器内形成真空，打出的流动相不连续。应松开盖子或留有1mm的缝隙; (7)进液管道阻塞或弯曲使泵抽不到液，注意调整进液管道或更换新的。其它问题包括渗漏或接头松动、泵部件损坏等，都能引起供液不正常。 03、流动相和储液器被污染 由于污染，噪音越来越大，检测器基线上升。污染物可能被泵以稳定的浓度打入系统，而再以稳定的浓度流出来，所以在色谱图中不出多余的峰。用梯度洗脱时弱流动相可以使污染物聚在柱顶，流动相强度增加后污染物可能被洗脱出来一个大的伪峰。有时基线噪音突然增大或突然提高，都是因为反复加进新的流动相或系统用得太久(通宵)所造成的。新加进的流动相有污染物或者流动相长霉，繁殖了细菌。 脏的储液器会污染清洁的流动相。每种流动相备有专用的储液器，或者定期报废储液器。 流动相污染来自这几个方面 04、试剂质量不高，玻璃器皿不合格; 微生物的影响; 配制流动相时操作不当等; 因此要求高纯度化学试剂和HPLC级溶剂; 玻璃器皿按规定清洗干净; 为防止微生物生长，每天要用甲醇清洗系统; 怀疑系统内生长了微生物，可用稀硝酸冲洗即可(注意不要损坏柱和管道系统); 真空脱气时防止泵油带入流动相; 用清洁的惰性塞子、搅棒、过滤器和玻璃器皿配制流动相; 已经污染的流动相一定要废弃掉。
下一篇：恒温水浴的操作使用及注意事项
449717568