色谱分析是以假定给定组分的保留值在分离条件不变时保留值恒定为基础的。对标准的液相色谱程序而言，每个峰都对应于一个组分，以标准品与样品中组分的保留时间相对应进行鉴别。恒定的保留时间对分析设计排列的样品很重要。 在液相色谱仪分析中常涉及到组分的保留值。保留值发生改变可使已建立的方法不能继续进行下去，或引起分析周期太长，或者峰分不开。应该找出引起保留值变化的原因。 除上述条件之外，引起保留变化的原因主要包括下列3种： 1.柱-柱之间； 2.日-日或日内：保留时间可能随时间而变化，如温度、柱温、pH值等对柱性能有影响，通常是所有的峰提前或延迟。 3.样品-样品间：偶尔也有样品与标准品的保留时间不同，可能是样品介质的影响。 以下重点讨论造成日-日间和日内保留时间变化的影响因素，它们主要是： a.分离条件控制差 除了色谱柱外，保留是温度、流动相组成和流速的综合体现，如果有一个条件变化，保留时间也会随之发生变化。 b.柱平衡慢 流动相组成或温度变化时，柱在新条件下再平衡需要一定的时间，在柱达到完全平衡钱不应进样。 c.柱钝化 长时间进样，柱会退化，强保留组分被柱不可逆的保留，导致所有组分保留减少。键合相层从填料微粒上剥落下来，会导致某些组分的保留增加，而另一组分的保留减少。 d.柱过载和样品介质相互作用 过大的样品量超出柱的线性范围，使保留减少。也可能是样品本身过载，从其它方面影响保留。
流动相相当于液相的血液，可以想象对液相的重要程度。那么流动相都需要注意什么呢? 01、过滤溶剂 溶剂在使用前一定要用0.5μm的过滤器过滤，如果使用固体化学试剂(缓冲盐)配制流动相，过滤特别重要，不能让固体微粒污染泵，阻塞进样器和柱头过滤片。本实验室有水溶性和脂溶性两种过滤膜供选择(反光面朝上)，过滤水溶性流动相时(如甲醇/水)，先用1～2mL甲醇润湿过滤膜，有助于快速抽滤。 02、保持储液瓶的清洁 用普通溶剂瓶作流动相储液器应不定期废弃瓶子，最后一次应用HPLC级的水或溶剂清洗，不能在清洗过程中留下污迹。 03、保证溶剂的质量 一定要用HPLC级的溶剂，水也应达到HPLC级，同样也要使用高纯度的缓冲盐。 一些因流动相引起的常见问题 01、流动相脱气不充分 流动相受热，或者流动相不同组分混合时会有气体产生，气泡进入泵内引起压力波动，增加噪音，色谱图上出现毛刺。可试用下列方法解决问题：流动相再脱气;采用更有效的脱气方法或两种方法配合使用;改系统内混合为系统外预混合。 02、流动相供给不畅 流动相用完，管道中吸入气体引起泵压力不稳。应经常观察储液器中流动相的量，加足流动相保证所有的样品分析完毕。输液管道上装沉子沉至瓶底，储液器盖上留一小孔正好夹住进液管，使其不能上下移动。 过滤器阻塞引起管道和泵腔空化，压力不稳。过滤器被微粒所阻塞或长霉，去掉过滤器后如果系统运转正常，说明已找出问题，换上新的过滤器则可。有时候换上新的过滤器仍然不畅，那就需要查查流动相的制备过程，或者换大孔径的过滤器。不管如何，流动相都需要重新过滤。 流速过高、阻力大，造成空化现象，这是由于过滤器孔径、管道内径、流速和溶剂黏度等引起的。如果流速大于10mL/min，常会出现这种现象。 使用下列方法解决： (1)使用低流速; (2)换大孔径的过滤器; (3)增加进液管道内径; (4)抬高或加压储液器; (5)不用过滤器，但流动相一定要先过滤; (6)储液器盖子太紧，在储液器内形成真空，打出的流动相不连续。应松开盖子或留有1mm的缝隙; (7)进液管道阻塞或弯曲使泵抽不到液，注意调整进液管道或更换新的。其它问题包括渗漏或接头松动、泵部件损坏等，都能引起供液不正常。 03、流动相和储液器被污染 由于污染，噪音越来越大，检测器基线上升。污染物可能被泵以稳定的浓度打入系统，而再以稳定的浓度流出来，所以在色谱图中不出多余的峰。用梯度洗脱时弱流动相可以使污染物聚在柱顶，流动相强度增加后污染物可能被洗脱出来一个大的伪峰。有时基线噪音突然增大或突然提高，都是因为反复加进新的流动相或系统用得太久(通宵)所造成的。新加进的流动相有污染物或者流动相长霉，繁殖了细菌。 脏的储液器会污染清洁的流动相。每种流动相备有专用的储液器，或者定期报废储液器。 流动相污染来自这几个方面 04、试剂质量不高，玻璃器皿不合格; 微生物的影响; 配制流动相时操作不当等; 因此要求高纯度化学试剂和HPLC级溶剂; 玻璃器皿按规定清洗干净; 为防止微生物生长，每天要用甲醇清洗系统; 怀疑系统内生长了微生物，可用稀硝酸冲洗即可(注意不要损坏柱和管道系统); 真空脱气时防止泵油带入流动相; 用清洁的惰性塞子、搅棒、过滤器和玻璃器皿配制流动相; 已经污染的流动相一定要废弃掉。
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