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液相色谱仪HPLC分析方法验证 液相色谱解决方案

时间:2020-05-17    来源:仪多多仪器网    作者:仪多多商城     
  为了保证分析检测结果准确、可靠,必须对所采用的分析方法的准确性、科学性和可行性进行验证,以证明分析方法符合检测的目的和要求,这就是分析方法验证。从本质上讲,方法验证就是根据检测项目的要求,预先设置一定的验证内容,并通过设计合理的试验来验证所采用的分析方法符合检测项目的要求。方法验证在质量控制上有重要的作用和意义,只有经过验证的分析方法才能用于药品生产的分析检测,方法验证是制订质量标准的基础。方法验证内容包括方法的专属性、线性、范围、准确度、精密度、检出限、定量限、耐用性和系统适用性等,检测目的不同验证要求也不尽相同。
 
  1.专属性
 
  专属性是指分析方法能够将产品和杂质分开的特性,也称为选择性。对于纯度检测,可在标准品中加入产品中的已知杂质,或者直接用粗品,考察产品峰是否受到杂质的干扰,对于过程跟踪,可用反应体系样品来考察有没有其它的杂质干扰。必要时使用二极管阵列检测器或者质谱检测器进行色谱峰纯度检查。一般要求产品和杂质之间的分离度大于2.0。
 
  2.线性
 
  线性是在设定的范围内,检测结果与样品中原料或产品的浓度呈线性关系的程度。线性是定量检测的基础,需要定量检测的项目都需要验证线性。一般用贮备液经过精密稀释,或分别精密称样,制备得到一系列被测物质的浓度(5个以上),按浓度从小到大运行序列,以峰面积和浓度的函数作图,用zui小二乘法进行线性回归计算,考察分析方法的线性。
 
  3.范围
 
  范围指在能够达到一定的准确度、精密度和线性时,样品中被分析物的浓度区间。简单的说,范围就是分析方法适用的样品中待测物的浓度zui大值和zui小值。需要定量检测的分析方法都需要对范围进行验证,纯度检测时,范围应为测试浓度的80%~120%。
 
  4.准确度
 
  准确度是指测定的结果与真实值之间接近的程度,所以也叫做真实度,需要定量得分析方法均需要验证准确度。准确度应在规定的范围内建立,对于原料药可用已知纯度的标准品或符合要求的原料药进行测定,必要时可与另一个已建立准确度的方法比较结果。
 
  5.精密度
 
  精密度是指在规定条件下,同一均匀样品经多次取样进行一系列检测所得结果之间的接近程度。精密度一般用相对标准偏差表示,取样检测次数应至少6次。
 
  精密度可以从三个层次考察:重复性、中间精密度、重现性。
 
  a、重复性是在相同的操作条件下、较短时间间隔内,由同一分析人员测定所得结果的精密度。一般是用100%浓度水平的样品测定6次的结果进行评价。
 
  b、中间精密度:同一实验室,在日期、分析人员、仪器等内部条件改变时,测定结果的精密度。
 
  c、重现性:指不同实验室之间不同分析人员测定结果的精密度。
 
  6.检出限
 
  检出限是指样品中的被分析物能够被检测到的zui低量,不需要准确定量。检出限体现了分析方法的灵敏度。检出限的测定可以通过对一系列已知浓度被测物的试样进行检测,以能准确、可靠检出被测物的zui小浓度来确定,也可把已知浓度样品的信号与噪声信号进行比较,以信噪比为3:1时的浓度确定检出限,一般要求能够达到进样浓度的0.05%。
 
  7.定量限
 
  定量限是指样品中的被分析物能够被定量检测的zui低量,其测定结果需要一定的准确度和精密度,定量限体现了分析方法灵敏定量检测的能力。检测需要严格控制含量的杂质,必须考察方法的定量限,以保证杂质能够被准确定量。一般以信噪比为10:1时相应的浓度或进样量来确定定量限。
 
  8.耐用性
 
  耐用性是指测定条件发生小的变动时,测定结果不受影响的承受程度,耐用性主要表明方法的抗干扰能力,主要的变动因素包括:流动相的组成、流速和pH值、色谱柱、柱温等。经试验,应说明小的变动能否符合系统适用性试验要求,以确保方法有效。
 
  9.系统适用性试验
 
  液相色谱分析方法主要依赖液相色谱仪和色谱柱,在做方法验证时,有必要将液相色谱仪、色谱柱、流动相与实验操作、待测样品等一起当作完整的系统进行评估,并将系统适用性作为分析方法的组成部分,系统适用性便是对整个系统进行评估的指标。一般系统适应性的要求为:分析方法能够达到0.05%的检出限,主峰的拖尾因子0.5 
  分析方法开发与验证是一个整体,在实际工作中,一般是先开发分析方法,经过适当的优化以后再做方法验证,验证的部分内容在分析方法开发时就要做,比如说分析方法的专属性验证。分析方法验证并非必须验证所有的内容,只要注意验证内容充分,足以证明分析方法的合理性就可以了,如杂质限度检测一般只需要验证专属性和检出限,而精密度、线性、定量限等涉及定量测定的项目,则不需要验证。
 
  有时需要对分析方法进行全面或部分的再验证。当原料药合成工艺发生改变时,可能引入新的杂质,杂质检查方法和含量测定方法的专属性就需要再进行验证,以证明有关物质检查方法能够检测新引入的杂质,且新引入的杂质对主成份的含量测定应无干扰。当分析方法发生部分改变时,如检测波长发生改变,则需要重新进行检测限、专属性、准确度、精密度、线性等内容的验证,以证明改变后的分析方法的合理性、可行性。

高效液相色谱仪的组成及分类

  一. 高压输液系统

  贮液装置、高压输液泵、过滤器、脱气装置等

  1. 贮液器:贮液器用于存放溶剂。溶剂必须很纯,贮液器材料要耐腐蚀,对溶剂呈惰性。贮液器应配有溶剂过滤器,以防止活动相中的颗粒进进泵内。溶剂过滤器一般用耐腐蚀的镍合金制成,空隙大小一般为2mm。

  2. 脱气装置:脱气的目的是为了防止活动相从高压柱内流出时,开释出气泡进进检测器而使噪声剧增,甚至不能正常检测。

  3. 高压输液泵  高压输液泵是高效液相色谱仪的重要部件,是驱动溶剂和样品通过色谱柱和检测系统的高压源,其性能好坏直接影响分析结果的可靠性。

  对高压泵的基本要求是:

  ①流量稳定;②输出压力高,最高输出压力为50Mpa;③流量范围宽,可在0.01~10ml/min范围任选。④耐酸、碱、缓冲液腐蚀。⑤压力波动小。

  2. 梯度洗脱装置  梯度洗脱是利用两种或两种以上的溶剂,按照一定时间程序连续或阶段地改变配比浓度,以达到改变活动相极性、离子强度或pH值,从而进步洗脱能力,改善分离的一种有效方法。当一个样品混合物的容量因子是范围很宽,用等度洗脱时间太长,且后出的峰形扁平不便检测时,用梯度洗脱可以改善峰形、并缩短分离时间。HPLC的梯度洗脱与GC的程序升温相似,可以缩短分析时间,进步分离效果。使所有的峰都处于较佳分离状态,而且峰形尖而窄。

  二. 进样器

  进样器一般要求密封性好,死体积小,重复性好,保证中心进样,进样时对色谱系统的压力和流量波动小,并便于实现自动化。

  高压进样阀是目前广泛采用的一种方式。阀的种类很多,有六通阀、四通阀,双路阀等。以六通进样阀较为常用。

  三.分离系统

  色谱分离系统包括色谱柱、固定相和活动相。色谱柱是其核心部分,柱应具备耐高压、耐腐蚀、抗氧化、密封不漏液和柱内死体积小、柱效高、柱容量大、分析速度快、柱寿命长的要求。通常采用优质不锈钢管制成。

  色谱柱按内径不同可分为常规柱、快速柱和微量柱三类。

  常规分析柱柱长一般为10~25cm,内径4 ~ 5mm,固定相颗粒直径为 5 ~ 10 mm。为了保护分析柱不受污染,一般在分析柱前加一短柱,约数厘米长,称为保护柱

  (微量分析柱内径小于l mm,凝胶色谱往内径3~12 mm,制备往内径较大,可达25 mm以上。)

  四. 检测系统

  检测器的作用是将柱流出物中样品组成和含量的变化转化为可供检测的信号,常用检测器有紫外吸收、荧光、示差折光、化学发光等。

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高效液相色谱仪 高效液相色谱仪的组成及分类_高效液相色谱仪

液相色谱柱怎么安装?

    液相色谱柱是一种用于液体色谱分析仪器,其结构主要有:    a、空柱由柱接头、柱管及滤片组装而成。    柱接头采用低死体积结构,柱接头是两端螺纹组件,一端是为7/16英寸外螺纹,另一端是3/16英寸的内螺纹(国内外已规范化)。7/16英寸外螺纹与1/4英寸柱管(Φ6.35mm)连接,中间放置压坏用于密封。3/16英寸的内螺纹与1/16英寸(Φ1.57mm)的连接管连接,中间也放置压环用于柱接头的密封。为了尽量减少柱外死体积,在安装色谱柱时,用Φ1.57mm连接管通过空心螺钉压环后要尽量插到底,然后再拧紧空心螺钉。压环被空心螺钉挤压变形后紧箍在连接管上(连接管通过压环后露出的管长度应严格控制在2.5mm长或其他固定尺寸)。    在两端柱接头内,柱管两端各放置一片不锈钢滤片(或滤网),用于封堵柱填料不被流动相冲出柱外而流失。空柱各组件均为316#不锈钢材质,能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性,故使用时要注意,柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂,以避免腐蚀。    b、柱填料:    液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的,柱子的分类是依据填料类型而定。    正相柱:多以硅胶为柱填料。根据外型可分为无定型和球型两种,其颗粒直径在3—10 ?m的范围内。另一类正相填料是硅胶表面键合—CN,-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。    反相柱:主要是以硅胶为基质,在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的非极性填料。也有无定型和球型之分。    常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、苯基等,其颗粒粒径在3—10 ?m之间。    安装方法:    a、拆开柱包装盒,确认色谱柱的类型、尺寸、出厂日期以及柱内贮存的溶剂。    b、拧下柱两端接头的密封堵头放回包装盒供备用。    c、 按柱管上标示的流动相流向,将色谱柱的入口端通过连接管与进样阀出口相连接(如条件允许,建议在柱前使用保护柱);柱的出口与检测器连接。连接管是外径为1.57mm、内径为0.1-0.3mm的不锈钢管。连接管的两端均有空心螺钉及密封用压环。在接管时一定要设法降低柱外死体积。连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力插到底,然后顺时针拧紧空心螺钉,直到拧不动为止,再用扳手继续顺时针拧1/4-1/2圈,切记不要用力过大。如色谱柱通过流动相加压后有漏液现象,请用扳手继续顺时针拧1/4圈,直至不漏液为止。

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