当色谱柱使用一段时间以后,柱内由于各种原因,滞留了一些高沸点组分或氧化物等,除柱效有所下降外,还可能出现基线波动或“鬼峰”。为了去除污染物,使柱效和基线恢复到原来的状态,称为色谱柱的再生。色谱柱的再生和柱老化有一定区别和不同,它是柱在使用一段时间柱性能下降,经处理后尽量恢复到原来性能的过程。 A、色谱柱在以下几种情况必须再生处理 a.使一段时间,柱效明显下降; b.柱被污染,特别是在程序升温时,基线漂移和噪声超过容忍程度或出现“鬼峰”; c.柱头塌陷,柱床短路或断位(在玻璃柱中容易发现),而出现尖峰或双重峰; d.峰形展宽,保留时间明显变化; e.待分离组分和固定相表面非特异性相互作用,引起保留时间较短的峰拖尾或出现双峰; B、毛细管柱再生的几种方法 a.用载气将色谱柱污染物冲洗出来; b.将柱头截去100mm 或更长一些; c.若使用交联的色谱柱,可在仪器上反复注射溶剂进行冲洗。常用的溶剂依次为丙酮、甲苯、乙醇、氯仿和二氯甲烷,每次可进样5~10μL; d.交联柱在仪器上冲洗无效时,可把柱拆下来用二氯甲烷或氯仿冲洗,溶剂用量视柱的污染程度而定,一般20mL 左右。 C、色谱柱再生前应注意的问题 当分析出现问题时,不能只考虑是柱问题,而马上进行再生。除上述情况外,还应考虑样品处理、进样技术、操作有无失误、数据处理参数有无改变等可能带来的问题。 a.衬管、预柱和检测器被污染也会引起基线不稳定、出现“鬼峰”或裂解峰; b.新的注射垫也会引起基线漂移和出现“鬼峰”; c.衬管密封欠佳、柱安装死体积或检测器固有特性也会引起较早出现峰的拖尾; d.分析系统发生变化(如漏气严重)也可能使保留时间突变; e.峰变宽,除柱效下降外也可能由柱外效应引起; f.进样量太大也会引起峰变宽、拖尾或保留时间变短; g.色谱柱长时间样品过载,保留时间也会变小等。 D、色谱柱再生时应注意的几个问题 1.如前所述和色谱柱老化一样,不是温度越高越好,时间越长越好;建议不要使用长时间烘烤的方法,来处理受到污染的色谱柱,因为烘烤时,温度会把污染的残留物变成不能溶解的物质,再用溶剂清洗也无济于事; 2.仪器在高灵敏度操作时,如:量程在1×10-11A/mV以下,痕量分析程序升温过程中,温度升到大于180℃后,基线明显漂移是不可避免的; 3.不同类型柱子,再生方法不同; 4.样品种类、组分、进样量不同或操作时间长短不同,再生方法也不同; 5.仪器本身条件如:气源种类、纯度、净化条件、进样口结构和操作检测器不同,再生柱方法也有区别; 6.高分子量组分污染色谱柱后,高温再生时间长会导致固定相的老化;使用交联或键合柱可以用溶剂漂洗再生,漂洗溶剂流动方向一定要从柱出口注入。应该注意,毛细管柱交联键合率通常不到90%,因此会漂洗掉未化学结合的液相部分,所以保留时间和分离状态会有所变化; 7.对于难挥发物,碳化物是不能通过再生除去,对于填充柱可以使用带衬管气化室进样器,对于毛细管可通过把柱入口切去30~50cm的方法除去污物段。有条件的可以使用预柱,把不挥发的有机物、无机物和颗粒材料阻留在预柱中,需要时更换预柱; 8.在某些情况下,色谱柱要在温度极限附近使用,这时基线漂移和大噪声已不可避免,柱的再生要求只能视情况而定; 9.不是所有色谱柱通过再生均能恢复原来性能。
反相液相色谱柱具有无与伦比的性能。即使对于非常难分离的碱性化合物,也可获得出色的峰形,从而改善了这些类型的样品的柱效和分离度。
反相液相色谱柱使用中的注意事项
1、新C18柱在使用前,须先用甲醇或乙腈试剂以20倍柱体积低流速冲洗,作用是使固定相能充分润湿、碳链舒展彻底,使反相液相色谱柱的性能达到更好状态。
具体操作是,将配制好65%的乙腈/水冲洗后,把色谱柱进口端连接在色谱仪上,出口端放空(不可连上检测器,以免污染了检测器),以0.1ml/min~0.5ml/min的低流速将色谱柱中的清稀溶液吹干,过20分钟后再接上检测器,以1.0ml/min的流速,继续冲洗2~8小时;
2、液相色谱仪检测分析样品完毕后,须冲洗色谱柱。尤其是流动相中含有酸或盐时,需将色谱柱中的酸或盐冲洗干净,通常建议用10%甲醇水冲洗20倍柱体积;
3、若反相液相色谱柱处于长期闲置状态时,要将色谱柱彻底冲洗,建议冲洗3-4小时以上,保存在纯有机试剂或高比例的有机试剂溶液中;
4、由于C18柱的固定相疏水性较强,在使用过程中尽量不要使用高水相条件,若水相比例过高易引起固定相疏水塌陷,引起柱效迅速下降,甚至造成不可逆的负面影响;由于碳载量高,表现尤为明显,建议使用过程中水相比例不超过90%;
5、压力升高、柱性能下降:通常为色谱柱被污染,对色谱柱进行再生处理可恢复部分柱效;
6、压力骤升:通常由盐析出或筛板堵塞引起,若是盐析出,用10%甲醇水低流速冲洗至压力恢复即可;若判断并非盐析出,以纯甲醇或10%甲醇水为流动相反冲色谱柱(将色谱柱反接,不接检测器),若反冲半小时仍无效果则说明反冲无效,需寻找其他原因。
在硅胶制造和键合技术方面进行了改进,因此能够获得这样优异的性能,并且这些技术完全由控制。