通常可以通过拧紧或更换管路接头来解决漏液的问题。但值得注意的是过份拧紧会导致金属接头的漏液和塑料接头的磨损。如果通过稍微拧紧接头不能解决漏液的问题,就必须将接头取下,检查是否损坏(例如,卡套损坏、密封表面有杂质);损坏的接头应该更换掉。
1. 接头处漏液。
一般通过拧紧、清洗、更换等方法即可解决。
2. 泵漏液。
检查单向阀、接头是否松动,若松动拧紧(不要太紧)即可;检查混合器和泵的密封是否损坏;
3. 进样阀漏液。
检查进样阀转子、密封口是否松动,若松动则拧紧;检查废液管是否堵塞或产生虹吸现象,疏通或更换废液管,保持废液管高于废液液面。
4. 色谱柱漏液。
尾端接头松动,拧紧接头;卡套内有填料,拆下卡套,清洗卡套,重新安装;筛板厚度不合适,更换合适的筛板。
5. 检测器漏液。
检查流通池垫片、窗口是否损坏,更换垫片或窗口;检查流通池是否阻塞,更换或者重新安装;检查废液管是否阻塞,更换废液管。
液相色谱柱在使用前,可以进行柱的性能测试,并将结果保存起来,作为今后评价柱性能变化的参考。但要留意: 液相色谱柱柱性能可能由于所使用的样品、活动相、柱温等条件的差异而有所不同;另外,在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是较佳条件),只有这样,测得的结果才有可比性。
1、样品的前处理:
a、可以使用活动相溶解样品。
b、使用予处理柱除往样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。
c、使用0.45μm的过滤膜过滤除往微粒杂质。
2、活动相的配制:
液相色谱是样品组分在柱填料与活动相之间质量交换而达到分离的目的,因此要求活动相具备以下的特点:
a、活动相对样品具有一定的溶解能力,保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保存在柱中)。
b、活动相具有一定惰性,与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。
c、活动相的黏度要尽量小,以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果;同时降低柱压降,延长液体泵的使用寿命(可运用进步温度的方法降低活动相的黏度)。
d、活动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器,可以使用对紫外吸收较低的溶剂配制。
e、活动相沸点不要太低,否则轻易产生气泡,导致实验无法进行。
f、在活动相配制好后,一定要进行脱气。除往溶解在活动相中的微量气体既有利于检测,还可以防止活动相中的微量氧与样品发生作用。
3、活动相流速的选择:
因柱效是柱中活动相线性流速的函数,使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱,要追求较佳柱效,可以使用较佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱,流速一般选择1ml/min,对于内径为4.0mm柱,流速0.8ml/min为佳。
首先从常规的几个部件做个简单的分析。
(一)输液泵应具备如下性能:
①RSD(流量稳定性)<0.3%;
②流量范围宽,0.1~5.0ml/min内连续可调,有的实验则需要更大流量;
③输出压一般应能达到150~400kg/cm2,流量越大,最高压力越低;
④液缸容积小,有助于减少流动相死体积,利于清洗。
⑤密封性能好,耐腐蚀。
(二)检测器
①紫外检测器,分为可变单波长检测器VWD和二极管阵列检测器DAD,可以检测有紫外吸收的物质
②荧光检测器,检测有荧光的物质
③视差折光检测器,通用型检测器,但对环境要求极为苛刻,而且灵敏度低
④ELSD,蒸发光散射检测器
⑤MSD,质谱检测器
常用的是紫外检测,然后是MSD和ELSD
(三)色谱柱
要求柱效高、选择性好,分析速度快等。目前市场上销售的用于HPLC的各种微粒填料如多孔硅胶以及以硅胶为基质的键合相、有机聚合物微球(包括离子交换树脂)、氧化铝、多孔碳等,其粒度一般为3,5,7,10μm等,柱效理论值可达5~16万/米。
一般的分析只需5000塔板数的柱效;同系物分析500即可;难分离物则可用2万的柱子。
因此一般10~30cm左右的柱长基本能满足复杂混合物分析的需要。所以要根据自己实际情况来选择合适的柱子。
柱效受柱内外因素影响,为使色谱柱达到较佳效率,除柱外死体积要小外,还要有合理的柱结构(尽可能减少填充床以外的死体积)及装填技术。即使可以的装填技术,在柱中心部位和沿管壁部位的填充情况总是不一样的,靠近管壁的部位比较疏松,易产生沟流,流速较快,影响冲洗剂的流形,使谱带加宽,这就是管壁效应。这种管壁区大约是从管壁向内算起30倍粒径的厚度。在一般的液相色谱系统中,柱外效应对柱效的影响远远大于管壁效应。
此外,温度在色谱分析中是个不容忽视的环境条件,环境温度对溶剂的溶解能力、色谱柱的性能、流动相的粘度都有影响。而且不同的检测器对温度的敏感度不一样。保持恒定的温度对实验而言是个绝对不容忽视的条件,因此也要留意注温箱的选择。以保证实验结果的准确性。
(四)进样器
进样装置要求:密封性好,重复性好,死体积小,保证中心进样,进样时对色谱系统的压力、流量影响小。而且进样方式多种多样,可分为隔膜进样、停流进样、阀进样、自动进样。自动进样器则是市场发展的趋势。
(五)数据处理系统
一般专业的液相色谱仪生产厂家都有自己配套的液相色谱仪控制软件。但有不少液相色谱仪可以使用通用型的色谱数据工作站进行数据计算处理。进口软件价格比较高,这个自己得根据资金选择了。