液相色谱法是一种以液体为流动相的色谱法，液相色谱法是现在应用十分广泛的一种液相色谱法，这种方法是20世纪60年代兴起的，经过不断的完善和发展，现已被应用于各个领域。在医药分析领域，液相检验的应用已经普及，而液相色谱法作为液相检验中的一种重要手段，也得到了大力的推广与应用，目前实验室常用的P230液相色谱仪。
液相色谱法及其系统构造
液相色谱法是以经典液相色谱法为基础，通过引入气相色谱理论而迅速发展起来的。区别于经典液相色谱法柱效低、时间长的特点，液相色谱法采用了高压泵、固定相和高灵敏度检测器等技术，因此其检测有高压、高速、、高灵敏度、检验速度快、分辨率高等特点，更适宜于分离、分析热稳定性差、高沸点、有生理活性及相对分子量比较大的物质。
HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、溶剂贮存器、检测器、检测数据记录器等组成。其中输液泵、色谱柱和检测器关键。制备型HPLC仪有馏分收集装置。新型HPLC仪增加了微机控制，可进行自动化仪器控制和数据处理。
输液泵性能的好坏直接影响分析结果的可靠性，好的输液泵应具备输出压力高，流量稳定、耐腐蚀，密封性能好，液缸容积小等特点；HPLC进样方式可分为：隔膜进样、阀进样、停流进样、自动进样，进样装置需要：密封性能好，重复性好，死体积小，对色谱系统的压力、流量影响小；色谱柱担负分离作用，是色谱系统的心脏，在选择色谱柱时要注意选择柱效高、选择性好，分析速度快的色谱柱；检测器是把洗脱液中组分的量转变为电信号，其要求线性范围宽、灵敏度高、重复性好、噪音低和适用范围广。
液相色谱的原理及分类
液相色谱的原理主要依靠分离机制，其分离方法有多种，相应的分离机制也不同。根据分离机制的不同主要有四种基本类型色谱法：吸附色谱、分配色谱、分子排阻色谱及离子交换色谱法，其他还有胶束色谱法、化学键合色谱法及亲和色谱法等类别。在液相检验中，分离是核心，而色谱是一种分离分析手段。无论是那种分离方法，其分离原理都是一个物理过程，与液相层析的原理相似：将要检测分析的化合物通过进样器放入液相色谱仪，流动相携带着其流过色谱柱，由于不同物质在固定相上的保留时间不同出现的峰高或者峰面积定量以及出峰时间的不同而达到分离，从而或检测药物中不同成分的含量、或分析药效，或测定药物残留物杂质成分的浓度。
药物含量检验中液相色谱的应用
药物含量检验中定量分析的准确与否，关键在于检测器所产生的信号是否与被测样品的量始终呈一定的函数关系。液相色谱仪可使输出信号与样品量好呈线性关系，这样进行定药物含量测定时既准确又方便。
例如，示差检测法就是用液相色谱测定多糖类药物，用电化学检测器检测的阴离子交换柱分离出多糖类药物，这种方法优于传统检验法，可直接对低浓度糖作定量分析，不需衍生和样品处理，在节约时间和资金的同时避免了有毒衍生试剂的使用。在检验中不同类型的糖(如单糖、糖胺聚糖、半乳糖、果糖等)适用于不同的离子交换柱。
药效检验中液相色谱的应用
药物的治疗效果取决于人体对药物的吸收，与药物成分及其代谢物在血液中的浓度有关。随着现代药物的选择性越来越高，所服用的剂量越来越低，这就需要提高药效。现阶段药效临床试验中采用人肝组织，选择液相色谱法检测药性药效，对混合物中微量组分进行结构分析，可搭配固定相和流动相以达到好的分离效果。
例如，用内标法检测血液中药物浓度的总量限度。内标法是液相色谱的一种常用测定方法。首先提取血液，然后根据规定的方法配制不含药物的溶液，注入到液相色谱仪中，记录为色谱图I，然后再配制含有药物的溶液，以相同的条件注样，记录为色谱图II。然后将图I与图II进行比较，则可以通过杂质峰确认杂质峰的面积，从而达到检验的效果。
药物残留中液相色谱的应用
通常药物在使用一段时间后在体内产生残留物会影响认得某些生理功能，也就是人们所说的食药三分毒，如何分析药物残留物成分，减少其引起的不必要危害，液相色谱法起到了重要的作用。质谱仪是完成药物代谢物毒性鉴定的主要工具，是制药工业中毒理学试验的基础。
今后的医药分析检验研究中，可以应用液相色谱法不受试样挥发性限制等优点，结合其它的先进技术，如色谱——光谱联用、柱切换技术、傅立叶变换红外线吸收光谱联用等，不断提高液相色谱在液相检验中的应用。
高效液相色谱法与气相色谱法一样，都属于色谱法，具有选择性高、分离效率高、灵敏度高、分析速度快等特点。下面就两种色谱法的应用范围、仪器构造等不同点进行比较。
一、气相与液相的概念
气相
气相色谱是一种物理的分离方法。利用被测物质各组分在不同两相间分配系数(溶解度)的微小差异，当两相作相对运动时，这些物质在两相间进行反复多次的分配使原来只有微小的性质差异产生很大的效果而使不同组分得到分离。
液相
高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上引用了气相色谱的理论。在技术上，流动相改为高压输送；色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而,使柱效大大高于经典液相色谱(每米塔板数可达几万或几十万)；同时，柱后连有高灵敏度的检测器可对流出物进行连续检测。
二、应用范围
气相
有着分离能力好、灵敏度高、分析速度快、操作方便等特点。受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析，一般对500℃以下不易挥发或受热易分解的物质部分可采用衍生化法或裂解法。
液相
高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此，不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大(大于400以上)的有机物(些物质几乎占有机物总数的75%～80%)。原则上，都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。据统计，在已知化合物中能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。
三、气相仪器构造
由载气源、进样部分、色谱柱、柱温箱、检测器和数据处理系统组成。进样部分、色谱柱和检测器的温度均在控制状态。
1.柱箱：
色谱柱是气相色谱仪的心脏，样品中的各个组份在色谱柱中经过反复多次分配后得到分离，从而达到分析的目的，柱箱的作用就是安装色谱柱。由于色谱柱的两端分别连接进样器和检测器，因此，进样器和检测器的下端(接头)均插入柱箱。柱箱能够安装各种填充柱和毛细管柱并且操作方便。色谱柱(样品)需要在一定的温度条件下工作，因此，采用微机对柱箱进行温度控制，并且由于设计合理，柱箱内的梯度很小。
对于一些成份复杂、沸程较宽的样品，柱箱还可进行三阶程序升温控制。且程序设定后自动运行无需人工干预，降温时还能自动后开门排热。
2.进样器：
进样器的作用是将样品送入色谱柱。如果是液体样品，进样器还必须将其汽化。因此，采用微机对进样器进行温度控制。
根据不同种类的色谱柱及不同的进样方式，共有五种进样器可供选择：
填充柱进样器
毛细管不分流进样器附件
毛细管分流进样器附件
毛细管分流/不分流进样器
六通阀气体进样器
3.检测器：
检测器的作用是将样品的化学信号转化为物理信号(电信号)。
检测器也需要在一定的温度条件下才能正常工作，因此，采用微机对检测器进行温度控制。
根据各种样品的化学物理特性，共有五种检测器可供选择：
氢火焰离子化检测器(FID)；
热导检测器(TCD)；
电子捕获检测器(ECD)；
氮磷检测器(NPD)；
火焰光度检测器(FPD)；
4.数据处理系统：
该系统可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作，使样品的分离、制备或鉴定工作能正确开展。
四、高效液相仪器构造
高效液相色谱仪主要有：进样系统、输液系统、分离系统、检测系统和数据处理系统组成。
1.进样系统
一般采用：隔膜注射进样器或高压进样间完成进样操作，进样量是恒定的。这对提高分析样品的重复性是有益的。
2.输液系统
该系统包括高压泵、流动相贮存器和梯度仪三部分。高压泵的一般压强为l.47～4.4×107Pa流速可调且稳定，当高压流动相通过层析柱时，可降低样品在柱中的扩散效应，可加快其在柱中的移动速度，这对提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。流动相贮存错和梯度仪，可使流动相随固定相和样品的性质而改变，包括改变洗脱液的极性、离子强度、pH值。
3.分离系统
该系统包括：色谱柱、连接管和恒温器等。
色谱柱一般长度为10～50cm(需要两根连用时，可在二者之间加一连接管)内径为2～5mm，由优质不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成，柱内装有直径为5～10μm粒度的固定相(由基质和固定液构成)，固定相中的基质是由机械强度高的树脂或硅胶构成，它们都有惰性(如，硅胶表面的硅酸基因基本已除去)、多孔性和比表面积大的特点，加之其表面经过机械涂渍(与气相色谱中固定相的制备一样)或者用化学法偶联各种基因(如，磷酸基、季胺基、羟甲基、苯基、氨基或各种长度碳链的烷基等)或配体的有机化合物。
因此，这类固定相对结构不同的物质有良好的选择性，例如，在多孔性硅胶表面偶联豌豆凝集素(PSA)后，就可以把成纤维细胞中的一种糖蛋白分离出来。
另外，固定相基质粒小，柱床极易达到均匀、致密状态，极易降低涡流扩散效应。基质粒度小、微孔浅，样品在微孔区内传质短。这些对缩小谱带宽度、提高分辨率是有益的。根据柱效理论分析，基质粒度小，塔板理论数N就越大。
这也进一步证明基质粒度小，会提高分辨率的道理。再者，高效液相色谱的恒温器可使温度从室温调到60℃通过改善传质速度，缩短分析时间，就可增加层析柱的效率。
4.检测系统
高效液相色谱常用的检测器有紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器三种：
(1)紫外检测器
该检测器适用于对紫外光(或可见光)有吸收性能样品的检测。
其特点：使用面广(如，蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用)；灵敏度高(检测下限为10-10g/mL)；线性范围宽；对温度和流速变化不敏感；可检测梯度溶液洗脱的样品。
(2)示差折光检测器
凡具有与流动相折光率不同的样品组分，均可使用示差折光检测器检测；糖类化合物的检测使用此检测系统。这一系统通用性强、操作简单，但是，灵敏度低(检测下限为10-7g/mL)，流动相的变化会引起折光率的变化；因此，它既不适用于痕量分析，也不适用于梯度洗脱样品的检测。
(3)荧光检测器
凡具有荧光的物质，在一定条件下，其发射光的荧光强度与物质的浓度成正比。因此，这一检测器只适用于具有荧光的有机化合物(如，多环芳烃、氨基酸、胺类、维生素和某些蛋白质等。。。)的测定，其灵敏度很高(检测下限为10-12～10-14g/mL)痕量分析和梯度洗脱作品的检测均可采用。
5.数据处理系统
该系统可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作，使样品的分离、制备或鉴定工作能正确开展。
五、高效液相色谱与气相色谱法优点和不足分析
只有20%样品可不经化学处理而能满意地用气相色谱分离，80%的有机化合物要用高效液相色谱分析。
气相色谱中流动相是惰性的，它对组分没有作用力，仅起运载作用、而高效液相色谱的流动相不仅起运载作用，而且流动相对组分有一定亲合力，可以通过改变流动相种类和组成提高分离的选择性；另外，可作流动相的化合物多，选择余地广。
与气相色谱相比，高效液相色谱仪的另一个优点是：样品的回收比较容易，只要开口容器放在柱子末端，就可以很容易地将所分离的各组分收集。回收是定量的，可以用来提纯和制备具有足够纯度的单一物质。
高效液相色谱不足的是，日前，检测器的灵敏度不及气相色谱。必须特别注意“柱外效应”对柱效率及色谱分离的影响。
以上内容由捷配仪器仪表网小编为您整理提供，希望能帮到您，祝您工作学习愉快
在我们常规思维中，色谱柱上标示的流向是不可改变的，每次使用都要遵循。可是，大家有没有想过这个方向的作用是什么呢？为什么要标示一个使用方向呢？
其实色谱柱前后端的填料及填装工艺都是一样的，标示方向的目的就是让我们在使用中记住流动相从哪个方向流入色谱柱，那么这个流入段就是最先污染端。这样就为我们日后维护或再生色谱柱做了准备，而我们需要遵循这个规定应该在色谱柱开始做样后。
我曾将已经污染过的色谱柱反方向来使用，如果保留时间不是很长，而色谱柱足够长，还是能使用一段时间的。
2.不去看说明书，直接就上机使用
色谱柱内部保存着什么溶剂一定要看清楚，因此色谱柱的说明书一定要看清楚，当然也包括说明书上建议的维护保养规定，对我们都非常的有用。对于反相柱来说，溶剂基本就是乙腈或甲醇。但正相柱就不同了，因为正相柱除了可以适用正相系统，也可以适用反相系统，因此一定要看清楚，对于你的方法来说是否需要置换色谱柱内部保存溶剂。
3.用纯水冲洗色谱柱才能把缓冲液冲洗干净
使用强溶剂冲洗色谱柱对内部填料的损伤是最大的，尤其是纯水，除非你的色谱柱是耐水的。冲洗色谱柱可以的方法是用流动相比例的水系和有机系来冲洗。如果你认为流动相比例无法把色谱柱冲洗干净或者此比例中有机系占有比例过大，你可以使用内含10%左右的纯水来冲洗。
4.保存在乙腈或甲醇中的新色谱柱可以直接使用
理论上液相色谱柱不同于气相色谱柱需要活化，但是由于液相色谱柱内部保存的有机系具有挥发性，因此在使用前还是应该用小流速的和色谱柱内部相同的溶剂冲洗一定的时间。可以是0.5ml/min，120min，但可以咨询厂家，根据色谱柱参数设定。
5.色谱柱应该保存在纯乙腈或甲醇中
根据第4条，色谱柱内部保存液具有挥发性，因此为了减少其挥发速度，可以添加5%-10%的水，这样的话可以在一定程度上减少一些有机系的挥发。如果再增加一个保险，我们可以在堵紧堵头后，再用封口膜封起来。同样道理，色谱柱一段时间不用后，也应该按照第4条，进行小流速的冲洗色谱柱。
6.色谱柱污染后把筛板卸下来超声清洗
对于色谱柱的污染，首当其冲的就是筛板，因此我们常用的做法就是把柱头卸下来，把筛板拿去超声清洗。但是我们在拆卸过程中对色谱柱前端填料的损害远远大于污染照成的伤害，因为我们不是专业的。因此建议这一步能不做就不做。
7.自己填装色谱柱
和第6条相同，这一步做法几乎可以把此色谱柱判死刑了，我们的填装工具有什么呢？就是手工的，其填装压力远远小于工厂内原始的填装压力。那么我们填装的结果会是个什么样也就很明显了。
在我看来，自己填装也就是练练手，熟悉一下这个过程，要把色谱柱维修好的可能性几乎为零。
8.用异丙醇冲洗再生后，柱子效果更差了
这种情况我自己就遇到过，还好那根柱子本来就打算报废了，因此也没有照成多少损失。但是这是什么原因呢？其实很简单，就是在我反向冲洗前没有把管路中的污染物冲洗干净就直接接了柱子。所以说，方法是没有错的，色谱柱受污染时，我们应该先想到仪器也污染了！
449717568