关键词: 高效液相色谱法L;胆固醇;大鼠海马;紫外检测器
摘要:胆固醇不仅在动脉粥样硬化等心血管疾病的发生发展中至关重要，而且在中枢神经系统的发育和功能活动中起着关键性作用［1］. 本资料用相对简单的高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)法测定了不同发育时期的大鼠海马胆固醇含量.
1材料和方法
1.1材料
湖北省医学科学院实验动物中心提供健康雄性Wistar乳鼠（出生24 h内）、幼鼠（28~30 d，体质量40~60 g）和成鼠（90~100 d， 体质量200~250 g）各10只. 乙腈、异丙醇、无水乙醇等都为色谱纯试剂,标准胆固醇(HPLC级)为美国Sigma公司产品. VARIAN Prostar 210高效液相色谱仪 (美国VARIAN公司生产),配置Prostar 210高压泵、VARIAN Prostar 500柱温箱、手动进样器.
1.2方法
1.2.1组织样品制备将大鼠快速活杀断头取海马称质量,按10 mL/g加无水乙醇在冰台上磨成匀浆,在20 600 g, 4℃离心2次，每次20 min,将上清液以0.45 μm的微孔滤膜滤过, 取滤液分装, -70℃保存待测.
1.2.2配制标准溶液和测定胆固醇标准胆固醇储备液(1 g/L):准确称取胆固醇66.18 mg溶于25 mL的无水乙醇中. 标准胆固醇工作液:取标准胆固醇储备液,分别以无水乙醇稀释使其浓度分别为0.1323, 0.26472, 0.6618, 1.3236, 2.6472 g/L. 美国安捷伦公司反相色谱柱(ZORBAX XDB C18 4.6*250 mm 5 μm, Agilent), 柱温38℃, 乙腈异丙醇(4∶1, V/V)为洗脱流动相对标准储备液和样品中胆固醇进行分离洗脱. 流速:0.8 mL/min;检测波长:208 nm;进样量:20 μL,Varian Prostar 325紫外检测器和美国Varian公司的LC Workstation V6.2色谱数据处理系统检测和处理色谱数据,获得胆固醇色谱图. 计算结果：X=10×0.9965×A×B÷CX: 样品中胆固醇的含量(mg/g). A: 样品中胆固醇的峰面积. 10: 样品稀释倍数(mL/g). B: 标准胆固醇的含量(g/L). C: 标准胆固醇的峰面积. 0.9965: 胆固醇标准品纯度.
统计学处理： 数据用x±s表示, 变量间比较用F检验.
2结果
2.1标准工作曲线在选择的色谱条件下,胆固醇的保留时间为13~15 min. 以胆固醇浓度分别为0.1323, 0.26472, 0.6618, 1.3236和2.6472 g/L的标准胆固醇工作液重复上样(重复3次),上样量为20 μL,以峰面积为纵坐标Y, 胆固醇浓度为横坐标X(g/L)，进行线性回归, 得到线性回归方程为:Y=837148.3+84898179X, 相关系数r=0.99993，P<0.01. 最低检测限为10 mg/L.
2.2回收率准确称取已知含量(12.8 mg/g)的样品0.1 g(精确至0.0002 g) ,准确加入1 mL浓度为1.3236 g/L的胆固醇标准品溶液. 按上述方法制备组织样品后加无水乙醇做平行样5个，测定胆固醇含量. 平均回收率为99.94%.
2.3精密度取浓度为1.3236 g/L的胆固醇标准品溶液,连续进样5次,测定结果表明其变异系数为1.2%.
2.4样品中胆固醇含量乳鼠、幼鼠和成鼠海马样品胆固醇色谱图. 胆固醇都在相同的保留时间被洗脱出来，其含量分别为2.92±0.03,11.20±1.41,12.91±1.25(mg/g), 经F检验和两两比较，相互间差别有极显著性意义（P<0.01）.
3讨论
我们用紫外检测器得到胆固醇最低检测限达10 mg/L，回收率和精密度均高. 故此法灵敏，结果准确、可靠，对临床和科研很有价值.
Mauch等［1］确定glia因子为胆固醇与载脂蛋白E复合形成的脂蛋白. 胆固醇对大鼠海马的发育和成熟的作用报道甚少［2,3］. 我们推测，在大鼠发育过程中，海马胆固醇含量渐增, 胆固醇对大鼠海马发育和成熟可能发挥了重要作用［4］.
【参考文献】
［1］ Mauch DH, Negler K, Schumaker S, et al. CNS synaptogenesis promoted by glialderived cholesterol［J］. Science, 2001; 294: 1354-1357.
［2］ 申军现,金卫林,鞠躬. 低密度体外培养大鼠海马神经元的形态学观察［J］.第四军医大学学报, 2003; 24(6)： 489-491.
［3］ 雷革胜，万业宏，王玉英，等. 应用红外可视脑片膜片钳技术研究大鼠海马CA1区神经元的电生理特性［J］. 第四军医大学学报,2004;25(13):1153-1157.
［4］ Hayashi H, Campenot RB, Vance DE, et al. Glial lipoproteins stimulate axoGrowth of central nervous system neurons in compartmented cultures［J］. J Biol Chem, 2004; 14(279):14009-14015.
高效液相色谱仪的系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱(固定相) 内， 由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数， 在两相中做相对运动时， 经过反复多次的吸附- 解吸的分配过程， 各组分在移动速度上产生较大的差别， 被分离成单个组分依次从柱内流出， 通过检测器时， 样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。高效液相色谱仪在使用过程中通常会遇到下面几个问题： 1. 色谱柱中的流动相会排干吗？ 不少做色谱分离试验的人遇到过这样的情形：不慎未及时补充流动相，泵将溶剂瓶中的流动相吸干了，HPLC系统由此而停止工作了。如此情况是否会损坏色谱柱？泵是否已将色谱柱中所有流动相都排干了？色谱柱还能使用吗？事实上，如果泵将溶剂瓶中的流动相吸干，并不会造成色谱柱的损坏。即使泵中充满了空气，泵也不会将空气排 入色谱柱。因为泵只能输送液体，而不能输送空气。相比之下，另一个更可能发生的情况是忘记盖上色谱柱两端的密封盖或盖子太松而使色谱柱变干。同样，整个色 谱柱干涸的情况不太容易发生，多半可能只是色谱柱两端的几个毫米变干了，因挥发掉所有溶剂是色谱柱变干需要相当长的时间。即使色谱柱真的变干了，也不一定 就不可救药了。可以尝试用一种完全脱气的、表面张力低的溶剂（如经氦气脱气的甲醇）冲洗色谱柱以除去气体。较低的表面张力有助于浸润填料表面；已脱气的溶 剂应该能够溶解并去除滞留在填料中的气体。色谱柱大约需要（以1mL/min的流速）冲一个小时或更多的时间被彻底浸润，恢复到正常状态。 2. 使用PEEK（polyetheretherketone）管路和接头需要注意什么问题？ 如果经常需要改变流路或更换不同品牌的色谱柱，使用PEEK材料制成的管路和接头会非常方便。PEEK管路容易连接；PEEK接头不仅无需工具，手拧即可固定，而且容易调节锥箍之外的管路长度，方便与不同品牌或规格的色谱柱相连接。 使 用此类材料的管路需要注意的是：PEEK对卤代烷烃和四氢呋喃的兼容性不好。虽然未观察到上述溶剂溶解PEEK材料的明显迹象，但PEEK遇到上述溶剂会 变脆。另一个西药考虑的因素是压力限。不锈钢管可耐受6000psi的压力，但PEEK管只能耐受近4000psi（但多数HPLC应用系统压力不会超过 3000psi）。 使用PEEK接头时则无需担心接头耐溶剂性能，因为接头几乎或很少与溶剂直接接触。但手拧固定的PEEK接头压力限低于不锈钢管，因而压力太高时，可能会使接头在管路上滑动而产生死体积或漏液。 3. 如何预防液相泵的故障: 要保持泵的良好操作性能,必须维护系统的清洁,保证溶剂和试剂的质量,对流动相进行过滤和脱气.下面列出预防泵故障的几项措施: 1).用高质量试剂和HPLC级溶剂； 2).过滤流动相和溶剂； 3).脱气； 4).每天开始使用时放空排气，工作结束后从泵中洗去缓冲液； 5).不让水或腐蚀性溶剂滞留泵中； 6).定期更换垫圈； 7).需要时加润滑油； 8).查阅有关泵操作手册中的其它建议。 处于良好操作状态的泵，应该能使色谱图上的基线平稳；保留时间的重复性好。在等度洗脱时压力波动小于2%。梯度洗脱时压力变化应是缓慢和平稳的。 为了使故障发生后尽快排除，平时应常备密封、单向阀（入口与出口）、泵头装置、各式接头、保险丝等部件，以及更换工具。使用高效液相色谱仪会遇到的问题
一.HPLC紫外灯的维护
对紫外灯的根本维护就是在不进行测定时应及时关灯。具体的做法为：
1.缩短检测前的开灯时间
尽量在检测前1小时开紫外灯，具体时间根据系统的稳定时间而定。太早会缩短灯的使用寿命太晚会浪费流动相，对色谱柱也不好。
2.检测结束后的关灯
在检测结束后应立即关灯，尽量采用仪器自动关灯。有人提出如果当天还有检测工作怎么办?我认为频繁的开关对灯显然也不利，立即关灯当然是指一天的检测都结束后。在一天工作开始时应考虑工作量让液相在合适的时候开始工作，保证检测的连续性，缩短开灯时间。如果必须在中间停一段时间，则应视所停时间而定。
二.HPLC紫外灯的更换
紫外灯何时更换说法不一。原先一般建议的使用时间为2000小时，现在不少液相厂家建议尽量使用1000小时后更换。我认为每个灯质量都不一样，具体时间可视灯的能量而定，如我们目前定的标准为800，每周一次检测灯能量并记录，当能量不足800时立即更换。
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