超高效液相色谱仪与普通高效液相色谱原理相同，因此，在使用中应注意的问题是相同的。 要想成为一个合格的色谱分析者，良好的实验规范与习惯是非常必要的。一些小细节的失误或忽视一些简单的问题往往导致实验结果不理想或损坏仪器，从而造成重大的损失。 而在使用中从最初的样品准备开始也有细节部分需要注意： 在保证目标物回收率的情况下，尽量除去样品中其它杂质。 选用合适的滤膜（滤膜有水溶型、脂溶型、通用型、超高效液相色谱用0.2?m）过滤样品，确保样品中不含固体颗粒。可以使用与初始流动相组成相同的溶剂溶解样品，在反相分析时，用比流动相极性更低的有机相；在用正相分析时，如在亲水色谱分析时，溶解样品的一定是高极性有机相，否则，会引起色谱峰的变形，比如保留时间提前、双峰等。 在保证灵敏度与准确度的前提下，进样量要尽量小。
反相高效液相色谱柱是基于溶质、极性流动相和非极性固定相表面间的疏水效应建立的一种色谱模式，任何一种有机分子的结构中都有非极性的疏水部分，这部分越大，一般保留值越高。 在高效液相色谱中这是应用面较广的一种分离模式，在生物大分子的反相液相色谱条件下，流动相多采用酸性的、低离子强度的水溶液，并加一定比例的能与水互溶的异丙醇、乙腈或甲醇等有机改性剂，大量使用的填料为孔径在30纳米以上的硅胶烷基键合相，除此之外，也有少量高聚物微球。 反相高效液相色谱柱的使用和维护 在色谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱。 (1)柱子在装卸、更换时，动作要轻，接头拧紧要适度。必须防止较强的机械振动，以免柱床产生空隙。 (2)如果仪器用来做常规分析，样品种类有限，但分析次数多，则不妨为每一类常规分析配置一根专用柱，这样有助于延长柱子的寿命。 (3)避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。 温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓。 (4)应逐 渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。 (5)如使用柱温控制装置时，应注意在通人流动相后才能升温。 (6)一般说来反相高效液相色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。 (7)选择使用适宜的流动相，以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一个预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶“饱和”，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。 (8)避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注人柱内，需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一个保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱。保护柱可以而且应该经常更换。 (9)经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右，即常规分析需要50-75mL。 (10)保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。 (11)反相高效液相色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进人柱内，使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。 (12)在完成分离分析工作之后，不应立即停机，需及时对色谱分析系统进行冲洗，一般0.5h以上，以除去色谱柱内的杂质。 在日常分离分析工作中，反相高效液相色谱柱的正确使用和维护十分重要，色谱柱使用是否得当，直接影响色谱柱的寿命，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。
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1)． 过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。
2)． 对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。
3)． 打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。
4)． 进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。
5)． 有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10 ml/min。
6)． 调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。
7)． 设计走样方法。点击file，选取select users and methods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击new method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。
8)． 进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。
9)． 关机时，先关计算机，再关液相色谱。
10)． 填写登记本，由负责人签字。
注意事项：
1)． 流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。
2)． 柱子是非常脆弱的，*次做的方法，先不要让液体过柱子。
3)． 所有过柱子的液体均需严格的过滤。
4)． 压力不能太大，不要超过2000 psi。
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