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反相液相色谱柱使用缓冲液需要注意哪些 液相色谱操作规程

时间:2020-06-20    来源:仪多多仪器网    作者:仪多多商城     
【导读】反相液相色谱柱采用高纯和高机械强度的硅胶,采用先进的键合技术制备而成, 色谱柱表面键合率高,覆盖完全,对碱性和酸性化合物具有良好的峰形。色谱柱柱容量高,



    反相液相色谱柱采用高纯和高机械强度的硅胶,采用先进的键合技术制备而成, 色谱柱表面键合率高,覆盖完全,对碱性和酸性化合物具有良好的峰形。色谱柱柱容量高,寿命长,是一款具有较高性价比的色谱柱。

    反相液相色谱柱在使用缓冲液的过程中还要注意以下几点:

    a、避免使用盐酸盐,盐酸盐对钢质有腐蚀作用;

    b、缓冲液可以要现配现用,往往缓冲液是良好的菌类培养液,隔天或放置长时间实验时会发生很多怪现象;

    c、使用缓冲液要及时掌握pH范围,做到胸中有数;

    d、清洗液路和柱子时,有温控可加热到30摄氏度易于冲洗;

    e、长时间用缓冲溶液要注意观察接头处有无析出,若有白色盐类析出,定期用10%硝酸冲洗液路可以避免液路的堵塞;

    f、选择缓冲液要用可靠的试剂,避免不纯的盐类造成不必要的麻烦;

    过渡流动相是指有机相和水相的组成与分析流动相相同,但是不含缓冲盐的溶液。






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高效液相色谱仪常见故障解决方法

  高效液相色谱仪是由储液器、泵、进样器、色谱柱、查看器、记录仪等几有些构成。储液器中的活动相被高压泵打入体系,样品溶液经进样器进入活动相,被活动相载入色谱柱(固定相、内,由于样品溶液中的各组分在两相中具有不一样的分配系数,在两相中作相对运动时,经过重复屡次的吸附-解吸的分配进程,各组分在移动速度上发生较大的不一样,被别离成单个组分顺次从柱内流出,经过查看器时,样品浓度被转换成电信号传送到记录仪,数据以图谱方式打印出来。

  高效液相色谱仪常见故障解决方法:

  故障1

  活动相内有气泡,封闭泵,翻开泄压阀,翻开purge键,清洁脱气,气泡不断从过滤器冒出,进入活动相,不管翻开purge键几回,都无法清除不断发生的气泡。

  因素过滤器长时刻沉浸于乙酸铵等缓冲液内,过滤器内部由于霉菌的成长繁衍,构成菌团,阻塞了过滤器,缓冲液难以流畅地经过过滤器,空气在泵的压力作用下经过滤器进入活动相。

  处理过滤器浸泡于5%硝酸溶液中,超声清洁几分钟即可;亦可将过滤器浸泡于5%硝酸溶液中12~36小时,悄悄震荡几回,再将过滤器用纯水清洁几回,翻开泄压阀,翻开purge键,清洁脱气,如仍有气泡不断从过滤器冒出,持续将过滤器浸泡于5%硝酸溶液中,如没有气泡不断从过滤器中冒出,阐明过滤器内部的霉菌菌团已被硝酸损坏,活动相能够流畅地经过过滤器。翻开泄压阀,翻开泵,流速调至1.0~3.0ml/min,纯水冲刷过滤器1小时摆布。即可将过滤器清洁洁净。封闭泄压阀,纯甲醇冲刷半小时即可。

  故障2

  柱压高因素:缓冲液盐分如(乙酸铵等)堆积于柱内;样品污染堆积。

  处理关于第一种状况先用40~50℃的纯水,低速正向冲刷柱子,待柱压逐步降低后,相应进步流速冲刷,柱压大幅度降低后,用常温纯水冲刷,之后用纯甲醇冲刷柱子30分钟;关于第二种状况,由样品的堆积导致污染的C18柱,和纯水反向冲刷柱子,然后换成甲醇冲刷,接着用甲醇+异丙醇(4+6)冲刷柱子(冲刷时刻的长短由样品污染的状况而定),再用换成甲醇冲刷,然后用纯水冲刷,最终甲醇冲刷正向冲刷柱子30分钟以上。

  故障3

  既无压力指示,又无液体流过[1>;。

  泵密封垫圈磨损;很多气泡进入泵体。

  处理关于第一种状况,替换密封垫圈;关于第二种状况,在泵作用的一起,用一个50ml的玻璃针筒在泵的出口处协助抽出空气。

  故障4

  压力动摇大,流量不稳定.

  因素体系中有空气或者单向阀的宝石球和阀座之间夹有异物,使得两者不能密封。

  处理作业中留意调查活动相的量,确保不锈钢滤器沉入储液器瓶底,防止吸入空气,活动相要充沛脱气[2>;。如为单向阀和阀座之间夹有异物,拆下单向阀,放入盛有丙酮的烧杯用超声波清洁.

  故障5

  出峰欠安,峰分叉。

  因素色谱柱被污染;柱头填料陷落。

  处理关于第一种状况,先用纯水反向冲刷柱子,然后换成甲醇冲刷,接着用甲醇+异丙醇(4+6)冲刷柱子(冲刷时刻的长短由样品污染的状况而定),再换成甲醇冲刷,然后用纯水冲刷,最终甲醇冲刷正向冲刷柱子30分钟以上。如冲刷后仍然出峰欠安,则考虑第二种状况。关于第二种状况,拧开柱头,查看柱填料是不是硬结或陷落。去掉硬结有些(污染的填料),装入新填料,滴一滴甲醇,填料下陷,再填,用与柱内径一样的顶端滑润的不锈钢杆压紧,再填平,滴甲醇,再压紧重复几回,直至装满填平;。柱头用甲醇冲刷洁净,擦净柱外壁的填料,拧紧柱头,用纯甲醇冲刷30分钟以上。

标签: 高效液相色谱仪
高效液相色谱仪 高效液相色谱仪常见故障解决方法_高效液相色谱仪 【导读】发展历史:1960年代,由于 气相色谱对高沸点有机物分析的局限性,为了分离蛋白质、核酸等不易气化的大分子物质,气相色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱。1960年代末科克兰(Kirkland)、哈

发展历史:1960年代,由于

气相色谱对高沸点有机物分析的局限性,为了分离蛋白质、核酸等不易气化的大分子物质,气相色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱。1960年代末科克兰(Kirkland)、哈伯、荷瓦斯(Horvath)、莆黑斯、里普斯克等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪,开启了高效液相色谱的时代。高效液相色谱使用粒径更细的固定相填充色谱柱,提高色谱柱的塔板数,以高压驱动流动相,使得经典液相色谱需要数日乃至数月完成的分离工作得以在几个小时甚至几十分钟内完成。
1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一书,标志着高效液相色谱法 (HPLC)正式建立。在此后的时间里,高效液相色谱成为较为常用的分离和检测手段,在有机化学、生物化学、医学、药物开发与检测、化工、食品科学、环境监测、商检和法检等方面都有广泛的应用。高效液相色谱同时还极大的刺激了固定相材料、检测技术、数据处理技术以及色谱理论的发展。
1960年代前,使用的填充粒大于100μm,提高柱效面临着困境,后来的研究人员便采用微粒固定相来突破着一瓶颈。科克兰、荷瓦斯制备成功薄壳型固定相,这种在固定相在玻璃微球表面具有多孔薄壳,实现了高速传质,为高效液相色谱技术的发展奠定了稳固的基础。随着填料粒径的降低,更高的柱效也得以实现。1960年代研制出气动放大泵、注射泵及低流量往复式柱塞泵,但后者的脉冲信号很大,难以满足高效液相色谱的要求。1970年代,往复式双柱塞恒流泵,解决了这一问题。1970年代后科克兰制备出全多孔球形硅胶,平均粒径只有7μm,具有极好的柱效,并逐渐取代了无定形微粒硅胶。之后又制造出的键合固定相使柱的稳定性大为提高,多次使用成为可能。1970年后,适合分离生物大分子的填料又成为研究的热点。1980年后,改善分离的选择性成为色谱工作者的主要问题,人们越来越认识到改变流动相的组成事提高选择性的关键。
高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)也叫高压液相色谱(high pressure liquid chromatography)、高速液相色谱(high speed liquid chromatography)、高分离度液相色谱(high resolution liquid chromatography)等。是在经典液相色谱法的基础上,于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀,小颗粒具有高柱效,但会引起高阻力,需用高压输送流动相,故又称高压液相色谱。又因分析速度快而称为高速液相色谱。
高效液相色谱是目前应用较多的色谱分析方法,高效液相色谱系统由流动相储液体瓶、输液、进样器、色谱柱、检测器和记录器组成,其整体组成类似于气相色谱,但是针对其流动相为液体的特点作出很多调整。储液器中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相,被流动相载入色谱柱(固定相) 内, 由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数, 在两相中作相对运动时, 经过反复多次的吸附- 解吸的分配过程, 各组分在移动速度上产生较大的差别, 被分离成单个组分依次从柱内流出, 通过检测器时, 样品浓度被转换成电信号传送到记录仪,数据以图谱形式打印出来。
HPLC的输液泵要求输液量恒定平稳;进样系统要求进样便利切换严密;由于液体流动相粘度远远高于气体,为了减低柱压高效液相色谱的色谱柱一般比较粗,长度也远小于气相色谱柱。HPLC应用非常广泛,几乎遍及定量定性分析的各个领域。
使用高效液相色谱时,液体待检测物被注入色谱柱,通过压力在固定相中移动,由于被测物种不同物质与固定相的相互作用不同,不同的物质顺序离开色谱柱,通过检测器得到不同的峰信号,最后通过分析比对这些信号来判断待侧物所含有的物质。高效液相色谱作为一种重要的分析方法,广泛的应用于化学和生化分析中。高效液相色谱从原理上与经典的液相色谱没有本质的差别,它的特点是采用了高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相,适于分析高沸点不易挥发、分子量大、不同极性的有机化合物。
高效液相色谱的特点:
高压——压力可达150~300 kg/cm2。色谱柱每米降压为75 kg/cm2以上。
高速——流速为0.1~10.0 mL/min。
高效——塔板数可达5000/米。在一根柱中同时分离成份可达100种。
高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。
HPLC与经典液相色谱相比有以下优点:
速度快——通常分析一个样品在15~30 min,有些样品甚至在5 min内即可完成。
分辨率高——可选择固定相和流动相以达到较佳分离效果。
灵敏度高——紫外检测器可达0.01ng,荧光和电化学检测器可达0.1pg。
色谱柱可反复使用——用一根色谱柱可分离不同的化合物。
样品量少,容易回收——样品经过色谱柱后不被破坏,可以收集单一组分或做制备。 
 
 

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