气相色谱和液相色谱各有其优缺点和应用范围:
气相色谱采用气体作为流动相,由于物质在气相中的流速比在液相中快得多,气体又比液体的渗透性强,因而相比液相色谱,气相色谱柱阻力小,可以采用长柱,例如毛细管柱,所以分离效率高。
由于气相色谱毋需使用有机溶剂和价格昂贵的高压泵,因此气相色谱仪的价格和运行费用较低,且不易出故障。能和气相色谱分离相匹配的检测器种类很多,因而可用于各种物质的分离与检测。特别是当使用质谱仪作为检测器时,气相色谱很容易把分离分析与定性鉴定结合起来,成为未知物质剖析的有力工具。气相色谱不能分析在柱工作温度下不汽化的组分,例如,各种离子状态的化合物和许多高分子化合物气相色谱也不能分析在高温下不稳定的化合物,例如蛋白质等。
液相色谱则不能分析在色谱条件下为气体的物质,但却能分离不挥发、在某溶剂中具有一定溶解度的化合物,例如高分子化合物、各种离子型化合物以及受热不稳定的化合物(蛋白质、核酸及其它生化物质)。
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液相色谱仪根据固定相是液体或是固体,又分为液-液色谱及液-固色谱。现代液相色谱仪由高压输液泵、进样系统、温度控制系统、色谱柱、检测器、信号记录系统等部分组成。与经典液相柱色谱装置比较,具有高效、快速、灵敏等特点。 1、 泵。 泵是液相色谱仪的心脏。处于良好工作状态的泵,基线平稳,保留时间重现性好,梯度洗脱时压力变化缓慢而且平稳。 1)选择优质的溶剂和试剂,在进入仪器前用 0.45um 膜过滤,并进行脱气处理。 2)泵开始使用时,一定要用合适的流动相彻底清洗干净。 3)定期检查并更换在线过滤片及有关的垫圈,经常清洗进液处的微孔滤头。 4)改变流动相时,应注意沉淀的产生,以防止泵堵塞。 2、色谱柱。 色谱柱是化合物分离的关键。保养良好的色谱柱具有很高的塔板数,基线平稳。 1)色谱柱比较娇气不能够碰撞、弯曲或强烈震荡;安装时要保证阀件或管路的清洁。 2)流动相在使用前必须进行脱气处理,尽量不使用或少使用高粘度的流动相。 3)在满足灵敏度的前提下,尽可能的使用小进样量。如果样品比较脏,要进行净化或提纯处理。 4)分析结束后要清洗掉进样阀中残留的样品,并用流动相或适当的溶剂清洗色谱柱。 5)如长期不用,用适当的有机溶剂保存并封闭或定期补充合适的流动相。 3 、检测器 分析完成后,马上关闭检测器。 4 、进样器 分析结束后反复冲洗进样口,防止样品的交叉污染或堵塞。
与液相色谱柱的性能相关的因素很多,基质(matrix)或者说担体、载体的化学性质、键合相(固定液)的化学性质、填料形状大小粒度分布、碳量和键合度等等。
色谱柱填料可以由基质直接构成,如硅胶、氧化铝、高交联度的苯乙烯-二乙烯苯或者甲基丙烯酸酯等等;也可以在这些基质的基础上涂布或化学键合固定液来构成,如:经典的各种ODS柱、氨基柱、氰基柱等。
一、基质的特点:
1、 硅胶
硅胶是陶瓷性质的无机物基质,刚性大,不易变形。化学性质较稳定,但对于水溶液尤其碱性水溶液仍然是不稳定的,即使表面经过良好的化学键合,覆盖了固定液,还是要注意水、碱性溶液、酸性溶液对硅胶的溶解作用,基质或者说是柱床(packed bed)溶解对色谱柱的影响是致命的。以硅胶为基质的填料构成了目前绝大多数的色谱柱填料。纯硅胶填料适宜分离溶于有机溶剂的极性、弱极性的非强离解型的化合物,硅胶也可以做凝胶色谱但柱效较低。硅胶基质键合固定相的高压液相填料,有其他填料无法比拟的高分离效能。
2、 二氧化铝
二氧化铝和硅胶相似,但对水溶液、酸性碱性水溶液溶液更加不稳定。所以,极少用作键合固定相的基质,也是适宜分离溶于有机溶剂的极性、弱极性的非强离解型的化合物,尤其是分离芳香族碳氢化合物。酸性易离解的化合物容易在二氧化铝上形成死吸附。另外,氧化铝分离几何异构体能力优于硅胶。
3、 聚合物填料
聚合物基质受压会变形,压力限度低但pH使用范围宽。苯乙烯-二乙烯苯基质疏水性强,使用任何流动相,在整个pH范围内稳定,可以用强酸、强碱来清洗色谱柱。甲基丙烯酸酯基质比苯乙烯-二乙烯苯疏水性更强,但可以通过适当的功能基修饰变成亲水性的。由于不耐压、有溶胀性,所以聚合物填料适宜用于大分子像蛋白质或合成的高聚物,另外还可以制成分子排阻、离子交换柱。近年发展迅速的大孔树脂,实际上主体就是苯乙烯-二乙烯苯聚合物或类似的合成高聚物。
由于硅胶基质的绝对地位,以下主要以硅胶为例。
二、形状大小粒度分布
基质要成为填料,首先要制成合适的形状和大小。硅胶形状有:薄壳型、无定形全多孔、球形全多孔,另外还有先做成微珠再堆积成球形全多孔的。通常只说不定形、球形。无定形全多孔的填料容易制备、价格低、粒度分布较均匀,但涡流扩散大,渗透性差,比较难填装出稳定的柱床,一般用来做制备柱。球形全多孔填料涡流扩散小,渗透性好;如果是硅胶先做成珠子再堆积而成的话,具有传质阻抗小、载样量大的优点,柱效也更高。球形填料外形对称,比较容易填出稳定的柱床。填料的大小一般不能直接测量,因为填料粒度有一定分布范围,一般给出的大小只是用一定方法测得的表观大小。填料大小与柱效、柱压的关系为:柱效与填料大小成反比,柱压与填料大小的二次方成正比。所以,快速分析柱使用3微米粒度的填料、一般做成5厘米长,就是为了降低柱压;需要注意到降低粒度所得到的柱效增加跟不上柱压的增加快。
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