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关于液相色谱仪的选择 液相色谱常见问题解决方法

时间:2020-06-29    来源:仪多多仪器网    作者:仪多多商城     
【导读】液相色谱仪是一种常见的色谱分析方法,与气相色谱相比液相色谱可以在常温中操作,且不受样品挥发度和热稳定性的限制。这使得液相色谱非常适合相对分子量较大,难



    液相色谱仪是一种常见的色谱分析方法,与气相色谱相比液相色谱可以在常温中操作,且不受样品挥发度和热稳定性的限制。这使得液相色谱非常适合相对分子量较大,难汽化,不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物和高聚物的分离分析。

 


    然而要选购一台品质优良的液相色谱并不容易。液相色谱仪的指标很多,有关于泵的、关于检测器的、关于色谱柱的……不过,从选购角度考虑,可以优先考虑噪音、漂移、最小检测浓度、定性定量重复性等主要技术指标。当然,这些指标都要放在系统、回路里去看去比较。


    1.噪音


    噪音指由仪器的电器元件、温度波动、电压的线性脉冲以及其他非溶质作用产生的高频噪声和基线的无规则波动产生的声音。噪音的大小直接关系到仪器的检测灵敏度,噪音越大检测的灵敏度就越低。对于检测低含量的样品就要求仪器的噪音越小越好,否则噪音过大将会导致基线不稳,甚至影响分析结果;


    2.最小检测浓度(最小检测限)


    最小检测浓度是反映仪器灵敏度的重要参数。根据公式CL=2×Nd×C/H(CL:最小检测浓度 Nd:噪音 C:样品浓度最小检测浓度 H:样品峰高),最小检测浓度是和噪音成正比的,噪音越大,最小检测浓度就越大,灵敏度就越低。如果选购的仪器回避了这个指标,说明他们不愿在最小检测浓度的基础上去比较噪音;


    3.漂移


    漂移是指仪器稳定后一段时间内基线漂离原点的距离,通常用来衡量仪器稳定快慢。高品质的仪器能在较短的时间内达到稳定,从而在一定程度上提高分析效率;


    4.定性定量重复性


    主要是考核仪器稳定性的指标,这对于分析样品来说是非常重要的。好的仪器其稳定性应该是十分不错的,这就要求多次进样保留时间及含量的一致性,这样做出来的结果才能使人信服。虽然这些指标都属于检测器,但是就像前面所说的,条件是要放在整个回路和系统里去看去比较。


    例如:泵的脉动会直接影响噪音指标、泵的流量准确度指标,以及密封性不好也会影响相关指标。所以要系统地看指标才可以反应出仪器的一些真实水平。


    在选择仪器的时候需要充分考虑到仪器的方方面面才能拿到自己满意的机器。


    首先从常规的几个部件做个简单的分析。


    (一)输液泵应具备如下性能:


    ① RSD(流量稳定性)<0.3%;


    ② 流量范围宽, 0.1~5.0ml/min内连续可调,有的实验则需要更大流量;


    ③ 输出压一般应能达到150~400 kg/cm2,流量越大,最高压力越低;


    ④ 液缸容积小,有助于减少流动相死体积,利于清洗。


    ⑤ 密封性能好,耐腐蚀。


    (二)检测器


    ①紫外检测器,分为可变单波长检测器VWD和二极管阵列检测器DAD,可以检测有紫外吸收的物质


    ②荧光检测器,检测有荧光的物质


    ③视差折光检测器,通用型检测器,但对环境要求极为苛刻,而且灵敏度低


    ④ELSD,蒸发光散射检测器


    ⑤MSD,质谱检测器


    常用的是紫外检测,然后是MSD和ELSD


    (三)色谱柱


    要求柱效高、选择性好,分析速度快等。目前市场上销售的用于HPLC的各种微粒填料如多孔硅胶以及以硅胶为基质的键合相、有机聚合物微球(包括离子交换树脂)、氧化铝、多孔碳等,其粒度一般为3,5,7,10μm等,柱效理论值可达5~16万/米。


    一般的分析只需5000塔板数的柱效;同系物分析500即可;难分离物则可用2万的柱子。


    因此一般10~30cm左右的柱长基本能满足复杂混合物分析的需要。所以要根据自己实际情况来选择合适的柱子。


    柱效受柱内外因素影响,为使色谱柱达到较佳效率,除柱外死体积要小外,还要有合理的柱结构(尽可能减少填充床以外的死体积)及装填技术。即使可以的装填技术,在柱中心部位和沿管壁部位的填充情况总是不一样的,靠近管壁的部位比较疏松,易产生沟流,流速较快,影响冲洗剂的流形,使谱带加宽,这就是管壁效应。这种管壁区大约是从管壁向内算起30倍粒径的厚度。在一般的液相色谱系统中,柱外效应对柱效的影响远远大于管壁效应。


    此外,温度在色谱分析中是个不容忽视的环境条件,环境温度对溶剂的溶解能力、色谱柱的性能、流动相的粘度都有影响。而且不同的检测器对温度的敏感度不一样。保持恒定的温度对实验而言是个绝对不容忽视的条件,因此也要留意注温箱的选择。以保证实验结果的准确性。


    (四)进样器


    进样装置要求:密封性好,重复性好,死体积小,保证中心进样,进样时对色谱系统的压力、流量影响小。而且进样方式多种多样,可分为隔膜进样、停流进样、阀进样、自动进样。自动进样器则是市场发展的趋势。


    (五)数据处理系统


    一般专业的液相色谱仪生产厂家都有自己配套的液相色谱仪控制软件。但有不少液相色谱仪可以使用通用型的色谱数据工作站进行数据计算处理。进口软件价格比较高,这个自己得根据资金选择了。


    二元泵和四元泵的区别二元有两个泵,泵后混合,气体的溶解度随压力的增大而增大,所以二元高压混合不会产生气泡。四元只一个泵(另外一个是辅泵),是泵前混合,在常压下进行的,两种液体混合时,会降低气体在混合溶液中的溶解度,通常会有气泡产生,所以四元低压梯度系统一定要配在线真空脱气机





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  异常的色谱峰指的是色谱图中的无峰或出现负峰、宽峰、双峰、肩峰、峰形不对称等情况。一般来说,异常峰是实验工作中较为棘手的问题。异常峰的出现会影响色谱分析的结果。通常情况下,峰型问题是由分离系统所决定的。在做液相过程中,我们就是要变换不同的条件来改善不好的峰型,对于各种各样的异常峰,要区别对待,从主要问题出发,一个一个加以解决。
 
  1.色谱图中未出峰
 
  系统未进样或样品分解;泵未输液或流动相使用不正确;检测器设置不正确
 
  2.一个峰或几个峰是负峰
 
  流动相吸收本底高;进样过程中进入空气;样品组分的吸收低于流动相。
 
  3.所有峰均为负峰
 
  信号电缆接反或检测器输出极性设置颠倒;光学装置尚未达到平衡。
 
  4.所有峰均为宽峰
 
  系统未达到平衡;溶解样品的溶剂极性比流动相差很多;色谱柱尺寸及类型选择不正确;色谱柱或保护柱被污染或柱效降低;温度变化造成的影响。
 
  5.所出峰比预想的小
 
  样品黏度过大;进样品故障或进样体积误差;检测器设置不正确.定量环体积不正确;检测池污染;检测器灯出现问题。
 
  6.出现双峰或肩峰
 
  进样量过大;样品浓度过高;保护柱或色谱柱柱头堵塞;保护拄或色谱柱污染或失效;柱塌陷或形成短通道。
 
  7.前伸峰
 
  进样量或样品浓度高,溶解样品的溶剂较流动相极性强;保护柱或色谱柱污染或失效。
 
  ①柱温低:升高柱温;②样品溶剂选择不恰当:使用流动相作为样品溶剂;③样品过载:降低样品含量;④色谱柱损坏:更换柱子。
 
  8.拖尾峰
 
  柱超载,降低样品量;增加柱直径采用较高容量的固定相;峰干扰,对样品进行清洁过滤;调整流动相;硅羟基作用,加入三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相pH值;柱内烧结不锈钢失效,更换烧结不锈钢;加在线过滤器,对样品进行过滤;死体积或柱外体积过大,将连接点降至谷值;尽可能使用内径较细的连接管;柱效下降,更换柱子;采用保护柱,对柱子进行再生。
 
  9.出现平头峰
 
  检测器设置不正确;进样体积太大或样品浓度太高。
 
  10.出现鬼峰
 
  进样阀残余峰,可能为上次样品的残余。在每次进完样后用充足的时间来平衡和清洗系统;样品中存在未知物,改进样品的预处理;流动相污染,更换新流动相,尽可能现配现用,隔夜的流动相再次使用时要过滤;尽可能使用HPLC级试剂;流路中有小的气泡,打开Purge阀,加大流速排除。
 
  11.峰分叉
 
  ①保护柱或分析柱污染:取下保护柱再进行分析,如果必要更换保护柱。如果分析柱阻塞,拆下来清洗。如果问题仍然存在,可能是柱子被强保留物质污染,运用适当的再生措施。如果问题仍然存在,入口可能被阻塞,更换筛板或更换色谱柱。②样品溶剂不溶于流动相改变样品溶剂,如果可能采取流动相作为样品溶剂。
 
  12.峰变形
 
  样品过载,减少样品载量。
 
  13.早出的峰变形
 
  样品溶剂选择不恰当 ①减少进样体积 ②运用低极性样品溶剂
 
  14.早出的峰拖尾程度大于晚出的峰
 
  柱外效应 ①调整系统连接(使用更短、内径更小的管路) ②使用小体积的流通池
 
  15.酸性或碱性化合物的峰拖尾
 
  缓冲不合适①使用浓度50~100 mM的缓冲液②使用Pka等于流动相pH值的缓冲液
 
  16.额外的峰
 
  (1)样品中有其他组分:正常现象;
 
  (2)前一次进样的洗脱峰:①增加运行时间或梯度斜率②提高流速;
 
  (3)空位或鬼峰:①检查流动相是否纯净 ②使用流动相作为样品溶剂 ③减少进样体积。

关于高效液相色谱仪流动相的选择如何呢?

  高效液相色谱仪分析中,选择流动相时应考虑流动相与填料的作用、纯度、与检测器的匹配、粘度、对样品的溶解度和样品回收等方面。

 

  1、流动相与填料的作用:

  流动相应不改变填料的任何性质。

  低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料有时遇到某些有机相会溶胀或收缩,从而改变色谱柱填床的性质。

  碱性流动相不能用于硅胶柱系统。

  酸性流动相不能用于氧化铝和氧化镁等吸附剂的柱系统。

  2、纯度:

  色谱柱的寿命与大量流动相通过有关,特别是当溶剂所含杂质在柱上积累时。

  3、与检测器的匹配:

  当使用UVD时,所用流动相在检测波长下应没有吸收或吸收很小。

  当使用RID时,应选择折光系数与样品差别较大的溶剂作流动相,以提高灵敏度。

  4、粘度:

  高粘度溶剂会影响溶质的扩散和传质,使柱效降低,还会使柱压增加,分离时间延长。尽量选择沸点在100℃以下的流动相。

  5、对样品的溶解度:如果溶解度欠佳,样品会在色谱柱内沉淀,不但影响纯化分离,而且会使色谱柱恶化。

  6、样品回收:应选用挥发性溶剂。

  高效液相色谱仪分析选择流动相时应注意的问题:

  1.尽量使用高纯度溶剂作流动相,防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。不纯的溶剂会引起基线不稳,产生伪峰。

  2.避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降和损坏色谱柱,如使固定液溶解流失和酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。

  3.样品在流动相中应有适宜的溶解度,防止产生沉淀并在柱中沉积。

  4.流动相粘度低(粘度适中)。若使用高粘度溶剂,会增高压力,不利于分离。常用低粘度溶剂有丙酮、甲醇和乙腈等。但粘度过低的溶剂也不宜采用,如戊烷等,它们容易在色谱柱和检测器内形成气泡,影响分离。

  5.化学稳定性好。

  6.流动相应满足检测器的要求。

  对于紫外吸收检测器,应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长长。所谓溶剂的紫外截止波长是指当小于截止波长的辐射通过溶剂时,溶剂对此辐射产生强烈吸收,此时溶剂被看作是光学不透明的,会严重干扰组分的吸收测量。

  对于示差折光检测器,要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相,以达到zui高灵敏度。

  液相色谱仪,看你分离的样品的种类,看流动相是否和样品互溶,分离程度,一般加水多少,甲醇,乙腈很多种,看样品的沸点,溶解性。

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