分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。
操作方法：
接通电源，打开仪器开关，掀开样品室暗箱盖，预热 10 分钟。
将灵敏度开关调至“1”档(若零点调节器调不到“0”时，需选用较高档。
根据所需波长转动波长选择钮。
将空白液及测定液分别倒入比色杯 3/4 处，用擦镜纸擦清外壁，放入样品室内，使空白管对准光路。
在暗箱盖开启状态下调节零点调节器，使读数盘指针指向 t=0 处。
盖上暗箱盖，调节“100”调节器，使空白管的 t=100，指针稳定后逐步拉出样品滑竿，分别读出测定管的光密度值，并记录。
比色完毕，关上电源，取出比色皿洗净，样品室用软布或软纸擦净。
三大注意事项：
分光光度计应放在干燥的房间内，使用时放置在坚固平稳的工作台上，室内照明不宜太强。热天时不能用电扇直接向仪器吹风，防止灯泡灯丝发亮不稳定。
分光光度计使用前，使用者应该首先了解本仪器的结构和工作原理，以及各个操纵旋钮之功能。在未按通电源之前，应该对仪器的安全性能进行检查，电源接线应牢固，通电也要良好，各个调节旋钮的起始位置应该正确，然后再按通电源开关。
分光光度计在仪器尚未接通电源时，电表指针必须于“0”刻线上，若不是这种情况，则可以用电表上的校正螺丝进行调节。
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分光光度计中zui简单的和应用zui普遍的一种。它的特点是只有一条光束。通过交换参比和样品的位置，使其分别进入光路。在参比（溶剂）进入光路时，调零。然后将样品进入光路的信号和参比信号进行比较，就可在显示器上读出样品的透过率和吸光度。
分光光度计的保养方法
1.若大幅度改变测试波长，需稍等片刻，等灯热平衡后，重新校正“0”和“100%”点。然后再测量。
2.指针式仪器在未接通电源时，电表的指针必须位于零刻度上。若不是这种情况，需进行机械调零。
3.比色皿使用完毕后，请立即用蒸馏水冲洗干净，并用干净柔软的纱布将水迹擦去，以防止表面光洁度被破坏，影响比色皿的透光率。
4.操作人员不应轻易动灯泡及反光镜灯，以免影响光效率。
5.1900型等分光光度计，由于其光电接收装置为光电倍增管，它本身的特点是放大倍数大，因而可以用于检测微弱光电信号，而不能用来检测强光。否则容易产生信号漂移，灵敏度下降。
针对其上述特点，在维修、使用此类仪器时应注意不让光电倍增管长时间暴露于光下，因此在预热时，应打开比色皿盖或使用挡光杆，避免长时间照射使其性能漂移而导致工作不稳。
6.放大器灵敏度换挡后，必须重新调零。
7.比色杯的配套性问题。比色杯必须配套使用，否则将使测试结果失去意义。在进行每次测试前均应进行比较。
具体方法如下;分别向被测的两只杯子里注入同样的溶液，把仪器置于某一波长处，石英比色杯;220nm、700nm装蒸馏水，玻璃比色杯：700nm处装蒸馏水，将某一个池的透射比值调至100%，测量其他各池的透射比值，记录其示值之差及通光方向，如透射比之差在±0.5%的范围内则可以配套使用，若超出此范围应考虑其对测试结果的影响。
分光光度计由于在每个波长都需要变换参比和样品的位置，所以只能手动，不能扫描吸收光谱。它的结构比较简单，使用也有一定限制，但如配置程序控制和打印装置，则对一些常规的定量测定还是比较适用的。
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