色谱柱利用色谱柱先将混合物分离，然后利用检测器依次检测已分离出来的组分。色谱柱的直径为数毫米，其中填充有固体吸附剂或液体溶剂，所填充的吸附剂或溶剂称为固定相。与固定相相对应的还有一个流动相。流动相是一种与样品和固定相都不发生反应的气体，一般为氮或氢气。待分析的样品在色谱柱顶端注入流动相，流动相带着样品进入色谱柱，故流动相又称为载气。载气在分析过程中是连续地以一定流速流过色谱柱的；而样品则只是一次一次地注入，每注入一次得到一次分析结果。
在实验过程中经常遇到的情况：
(1) 新的色谱柱，直接上分析条件来分析样品，发现分离情况不稳定。
(2) 新的色谱柱，使用中发现压力突然升高。
(3) 新的色谱柱，发现分离度、保留时间发生了变化。
(4) 色谱柱使用不频繁，一开始分析样品效果比较好，但是，在使用过程中发现柱效下降快、峰形异常的情况。
(5) 色谱峰形异常，基线不稳。
当发生以上情况，请仔细检查，是否有某个操作疏忽了？
1）测试柱性能
通常情况下，我们建议用户在拿到色谱柱后，件事情就是在一台性能完好的仪器系统上，按照厂家说明书对色谱柱进行柱效测试。其实，对于一个合格的色谱分析工作者来说，拿到一根新色谱柱，要开始一个课题之前，都会这样做，目的有二：1、了解色谱柱之前的情况并判断色谱柱是否正常。2、将检测结果小心保存， 当实验过程中发现异常时，在检测柱效进行对比，来进一步排查原因。
2）当反相使用高浓度缓冲盐时，注意过渡
在使用高浓度的盐或缓冲液作洗脱剂时，一定要注意应先用10％左右的低浓度的有机相洗脱剂过渡一下，否则缓冲液中的盐在高浓度的有机相中很容易析出，造成系统堵塞。另外，在发现系统压力升高异常时，要仔细检查，段段排除包括保护柱、混合器、管路或者流通池等。
3）当更换色谱柱时，原来的实验情况发生变化
首先，如果之前开发方法时色谱柱已经做过别的样品，那么之前的样品或使用的流动相对这个样品分析可能有干扰，只能重新找条件。建议：开发方法时使用新的色谱柱。（其次，如果是更换了品牌发生这样的情况，可能是由于不同品牌的键合技术不同，造成了选择性的细微差异 ，需要调整条件，并再次确定出峰顺序（有些样品的洗脱顺序会改变）。再次，如果是更换了同品牌型号的新的色谱柱发生这种情况，请检查之前分离时目标与杂质的分离度是否符合要求（Rs大于1.5），如果一开始只是勉强分开（Rs小于1.5），那只能说明方法没有优化好，需要再次进行优化。
4）样品及前处理
样品要尽可能清洁，可选用样品过滤器或样品预处理柱（SPE）对样品进行预处理；若样品不便处理，要使用保护柱。流动相中所使用的各种有机溶剂要使用色谱纯，配流动相的水应该是超纯水或双蒸水。如果将所配得流动相再经过0.45μm的滤膜过滤一次则更好，尤其是含盐的流动相。另外，装流动相的容器和色谱系统中的在线过滤器等装置应该定期清洗或更换。
5）色谱柱基线问题
通常情况，基线问题是由于系统或者流动相引起的，和色谱柱关系不大。
可能导致的原因：
（1）泵头进气泡
（2）系统污染
（3）流通池漏液
（4）流动相使用的某成分易挥发不稳定（检测波长不合适）
（5）检测波长低，水的质量不好等等
（6）色谱柱冲洗保养
当使用了缓冲液或含盐的流动相，实验完成后应用10%的甲醇水溶液冲洗30分钟，洗掉色谱柱中的盐，再用甲醇冲洗30分钟。注意：不能用纯水冲洗柱子，应该在水中加入至少10%的甲醇，防止将填料冲塌陷。还有就是不能在这个工作上面打折扣，否则，一些保留强的杂质没有洗脱下来，只能是给后面的工作带来更大的麻烦。如色谱柱要长时间保存，可以储存于纯甲醇或乙腈中，并将购买新色谱柱时附送的堵头堵上。储存的温度选择室温。
色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。在色谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱。
1.避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓（如前所述）。
2.选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶“饱和”，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。
3.应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。
4.一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。
5.避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱。保护柱可以而且应该经常更换。
6.经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右，即常规分析需要50~75ml。
7.色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内，使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。
8.保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。
新色谱柱开启和安装的推荐步骤：
1. 开启色谱柱的包装盒，查看色谱的测试报告；
2. 根据色谱柱身上箭头标明的流向先将色谱柱入口端连入系统，柱出口端先不要连接；
3. 0.1 mL/min 流速条件下用纯乙腈润洗色谱柱，然后在2 min内将流速升至0.5 mL/min;
4. 当溶剂均匀的从柱出口端流出，停流速，将色谱柱出口端接到系统检测器上；
5. 重启流速，然后在0.1 mL/min 流速条件下用纯乙腈润洗色谱柱30 min，在10 min内将流速升至1.0 mL/min冲洗30 min。
6. 参考柱效测试报告中的方法，30 min内将流动相梯度转换到柱效测试的流动相条件，然后使用5-10倍柱体积的流动相平衡色谱柱，直至压力与基线稳定。
7. 测试柱效。如果柱效与出厂报告偏移过大，或峰形拖尾就需要进行故障排查或联系上海易创分析仪器有限公司。
反相色谱柱的清洗与再生：
1. 发现柱压升高，色谱峰出现严重拖尾、肩峰甚至峰分岔，或分离度降低，有可能是样品溶解度、色谱柱温度、碱性化合物干扰，也很有可能是色谱柱受污染，可以采取以下措施：
2. 如系统有连接在线过滤器或保护柱，首先排查在线过滤器与保护柱，可能需要更新。
3. 使用纯有机相低流速冲洗过夜。（如有使用缓冲盐，应使用不含缓冲液的流动相冲洗1h，然后再梯度过渡到纯有机相低流速冲洗过夜。）
4. 如有机相清洗不能解决问题，可采用如下方法进行色谱柱的清洗和再生。根据样品的性质以及你了解的污染物性质选择清洗方法，用20-30倍柱体积（4.6*250 mm分析色谱柱大约80-120 mL溶剂清洗，流动相温度升至30-50 oC，然后再重复步骤3的方法。
5. 氨基柱
反相色谱柱的保存：
1. 反相色谱柱应保存于纯有机相中（如乙腈或甲醇）。色谱柱使用于高温或极端pH条件下，或停用超过48小时，应当进行简单的清洗过程；
2. 清洗首先用不含缓冲盐的流动相冲洗20-30倍柱体积, 然后30 min内梯度过渡到纯有机相，再用纯有机相冲洗20-30倍柱体积；
3. 后使用原配的柱堵头拧紧，确保堵头溶剂不会挥发。若是氨基柱则应该在步骤2中添加0.1%的氨水，有利于延长氨基柱的寿命；
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