、准备好工具和所需部件。工具包括扳手、超声清洗器、密封圈安静工具、新密封圈。用水-甲醇冲洗泵，拆开进出口管道，在泵头和单向阀上标出液流方向。
第二、将柱塞杆缩至小，松开泵头的收紧螺钉，小心托住泵头。操作时要注意处处以平衡的动作慢慢退出泵头，切不可摇动或上下左右摆动泵头。
第三、从密封圈孔中轻轻拔出旧密封圈，注意不要化泵头内壁，要毫不犹豫地随即扔掉旧密封圈。
第四、将泵头和新密封圈分别放入甲醇中超声清洗，同时用无纤维纸擦洗柱塞杆。察看柱塞杆上有无划痕，如有划痕应换新柱塞杆然后再安装密封圈，
第五、安装新密封圈。这一步要用专门的安装工具，切不可粗心大意，避免损坏密封圈。
第六、重新装上泵头。先在柱塞杆上滴几滴甲醇以湿润，滑动泵头到位。千万不能摇动或摆动，以防柱塞杆在这一步操作时折断。平衡地上紧固定螺丝，接上进液管道。
后、打脱气甲醇到泵腔中，不断用纸巾从泵出口处吸去流出的液体，等到无气泡一处再接上输出管道，打开放空阀，继续抽20mL甲醇赶走气泡后，换成需要使用的流动相。
Agilent液相色谱仪标准操作程序
1.目的：建立一个液相色谱的标准操作程序。
2.范围：适用于Agilent液相的使用。
3.责任：使用Agilent液相的化验员。
4.程序
4.1工作环境
实验室温度为20～27℃，温度变化<3℃/hr，相对湿度<80%，液相色谱仪工作台，长2米、宽0.8米、承重大于80公斤，离墙距离0.3米以上。单相交流220V，（+5%～10%），50～60Hz，有单独的良好接地。配置稳压电源，功率大于2.5千瓦。
4.2使用前的准备
4.2.1二次蒸馏水，（建议用0.45微米水相滤膜过滤）；甲醇或乙晴（色谱纯），（建议用0.45微米有机相滤膜过滤）；其他样品所需流动相，（都需经过0.45微米滤膜过滤）。将上述溶剂放入超声波池，除去气泡，方可使用。
4.2.2把流动相放入溶剂瓶中，打开purge阀，单击pump图标，出现参数设定菜单，单击setup选项，进入pump编辑画面，设flow：5ml/min，单击OK；单击pump图标，出现参数设定菜单，单击pump control选项，选中ON，单击OK，则系统开始purge，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止，切换通道继续purge，直到所有要用通道无气泡为止；单击pump图标，出现参数设定菜单，单击setup选项，进入pump编辑画面，设flow：1.0ml/min，关闭purge valve。单击pump下的的瓶图标，输入溶剂的实际体积和瓶体积，也可输入阻止分析和关泵的体积，单击OK。
4.2.3进行样品前处理（稀释或溶解至所需浓度）。
4.3实验步骤
4.3.1准备
4.3.1.1开启Agilent 1100LC各模块电源。
4.3.1.2打开计算机，双击online图标。
4.3.1.3从"view"菜单中选择"method and run control"画面，单击"view"菜单中的"show top toolbar","show status toolbar","system diagram","sampling diagram"使其命令前有"√"标志。
4.3.2数据采集方法编辑
4.3.2.1从“method"菜单中选择"edit entire method"项，选中除"data analysis"外的三项，单击OK，进入下一画面。
4.3.2.2在"method comments"中加入方法的信息（如This is for test!），单击OK进入下一画面。
4.3.2.3泵参数设定
在"flow"处输入流量1ml/min，在"solvent"处输入流动相中各溶剂所占的比例，也可"insert"一行"timetable",编辑梯度。在"pressure limits max"处输入柱子的zui大耐高压，以保护柱子，单击OK进入下一画面。
4.3.2.4柱温箱参数设定
在"temperature"下面的方框内输入所需的温度，并选中它点击"more>>"键，如图所示，选中"same as left"使柱温箱的温度左右一致，点击OK进入下一画面。
4.3.2.5 VWD检测器参数设定
在"wavelength"下方的空白处输入所需的检测波长，在"peak width(response time)"下方点击下拉式三角框，选择合适的响应时间，如>0.1min 。 在"timetable"中可以"insert"一行，可以输入随时间切换的波长。
4.3.2.6在"run time checklist"中，选中"data acquisition"，单击OK。
4.3.2.7单击“method"菜单，选中"save method as"，输入一方法名，单击OK。
4.3.2.8从"run control"菜单中选择"sample info"选项，输入操作者姓名，在"data file"中选择"manual"或"prefix"。
4.3.2.9从"instrument"菜单中，选择"system on"。
4.3.2.10单击OK，等仪器ready，基线平稳，从"method"菜单中选择"run method"，进样。
4.3.2.11进样时，阀门位置处于"inject"位置，进样针取样量应为所规定体积的三倍，用滤纸拭净针头表面残留液，进样时要轻而快，进样完毕应快速将阀门搬至"load"位置，进样完毕，数分钟后将进样针拔下，阀门回复到"inject"位置。 4.3.3数据分析方法编辑
4.3.3.1从"view"菜单中，单击"data analysis"进入数据分析画面。
4.3.3.2从"file"菜单中选择"load signal"选项，选中您的数据文件，单击OK。
4.3.3.3做谱图优化，从"graphics"菜单中选择"signal options"选项，从"ranges"中选择"auto scale"及合适的显示时间，单击OK，或选择"use ranges"调整。反复进行，直到图的比例合适为止。
4.3.3.4积分
4.3.3.4.1从"integration"中选择"auto integrate"，如积分结果不理想，再从菜单中选择"integration events"选项，选择合适的"slope sensitivity","peak width","area reject","height reject"。
4.3.3.4.2从"integration"菜单中选择"integrate"选项，则数据被积分。
4.3.3.4.3如积分结果不理想，则重复上两步动作，直到满意为止。
4.3.3.4.4单击左边"√"图标，将积分参数存入方法。
4.3.3.5打印报告
4.3.3.5.1从"report"菜单中选择"specify report"选项，进入。
4.3.3.5.2单击"quantitative results"框中"calculate"右侧的黑三角，选择所需的报告形式，其他选项不变，单击OK。
4.3.3.5.3从"report"菜单中选择"print report"，则报告结果将打印到屏幕上，如想输出到打印机上，则单击"report"底部的"print"钮。
4.3.4关机
4.3.4.1关机前，先用水和有机溶剂对系统进行梯度冲洗，然后再用有机溶剂冲洗系统，然后关泵（适用于反相色谱柱）。[正相色谱柱用适当的溶剂冲洗]
4.3.4.2退出化学工作站，及其他窗口。
4.3.4.3关掉Agilent1100电源开关，计算机（用shut down关）。
4.4.1色谱柱长时间不用，存放时，柱内应充满溶剂，两端封死。
4.4.2对于手动进样器，当使用缓冲液时，要用水冲洗进样口，同时搬动进样阀数次。
4.4.3流动相使用前必须过滤、超声，不能使用多日存放的纯化水（易长菌），应每天更换纯化水。
液相色谱系统的许多问题都能在谱图上反映出来。其中有一些问题可以通过改变设备参数得到解决；而有些问题必须通过修改操作程序来解决。本文汇总了一些关于液相色谱图谱问题的解决办法，这些办法也许能更有效的帮你解决问题。
1峰拖尾
原因和解决方法
1、筛板阻塞
a、反冲色谱柱
b、更换进口筛板
c、更换色谱柱
2、色谱柱塌陷
填充色谱柱
3、干扰峰
a、使用更长的色谱柱
b、改变流动相或更换色谱柱
4、流动相PH选择错误
调整PH值。对于碱性化合物，低PH值更有利于得到对称峰
5、样品与填料表面的溶化点发生反应
a、加入离子对试剂或碱性挥发性修饰剂
b、更改色谱柱
2峰前延
原因和解决方法
1、柱温低
升高柱温
2、样品溶剂选择不恰当
使用流动相作为样品溶剂
3、样品过载
降低样品含量
4、色谱柱损坏
更换色谱柱
3峰分叉
原因和解决方法
1、 保护柱或分析柱污染
取下保护柱再进行分析。如果必要更换保护柱。如果分析柱阻塞，拆下来清洗。如果问题仍然存在，可能是柱子被强保留物质污染，运用适当的再生措施。如果问题仍然存在，入口可能被阻塞，更换筛板或更换色谱柱。
2、样品溶剂不溶于流动相
改变样品溶剂。如果可能采取流动相作为样品溶剂。
4峰变形
原因和解决方法
1、样品过载
减少样品载量
5早出的峰变形
原因和解决方法
1、样品溶剂选择不恰当
a、减少进样体积
b、运用低极性样品溶剂
6早出峰拖尾程度大于晚出峰
原因和解决方法
1、柱外效应
a、调整系统连接（使用更短、内径更小的管路）
b、使用小体积的流通池
7K’增加时，脱尾更严重
原因和解决方法
1、二级保留效应，反相模式
a、加入三乙胺（或碱性样品）
b、加入乙酸（或酸性样品）
c、加入盐或缓冲剂（或离子化样品）
d、更换一支柱子
2、二级保留效应，正相模式
a、加入三乙胺（或碱性样品）
b、加入乙酸（或酸性样品）
c、加入水（或多官能团化合物）
d、试用另一种方法
3、二级保留效应，离子对
加入三乙胺（或碱性样品）
8酸性或碱性化合物的峰拖尾
原因和解决方法
1、缓冲不合适
a、使用浓度50-100mM的缓冲液
b、使用Pka等于流动相PH值的缓冲液
9额外的峰
原因和解决方法
1、样品中有其他组份
2、前一次进样的洗脱峰
a、增加运行时间或梯度斜率
b、提高流速
3、空位或鬼峰
a、检查流动相是否纯净
b、使用流动相作为样品溶剂
c、减少进样体积
10保留时间波动
原因和解决方法
1、温控不当
调好柱温
2、流动相组分变化
防止变化（蒸发、反应等）
3、色谱柱没有平衡
在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱
11保留时间不断变化
原因和解决方法
1、流速变化
重新设定流速
2、泵中有气泡
从泵中除去气泡
3、流动相选择不恰当
a、更换合适的流动相
b、选择合适的混合流动相
12基线漂移
原因和解决方法
1、柱温波动
控制好柱子和流动相的温度，在检测器之前使用热交换器
2、流动相不均匀
（流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。）
使用HPLC级的溶剂，高纯度的盐和添加剂。流动相在使用前进行脱气，使用中使用氦气。
3、流通池被污染或有气体
用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池。如有需要，可以用1N的硝酸。（不要用盐酸）
4、检测器出口阻塞
（高压造成流通池窗口破裂，产生噪音基线）
取出阻塞物或更换管子。参考检测器手册更换流通池窗。
5、流动相配比不当或流速变化
更改配比或流速。为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速。
6、柱平衡慢，特别是流动相发生变化时
用中等强度的溶剂进行冲洗，更改流动相时，在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。
7、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成
检查流动相的组成。使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂
8、样品中有强保留的物质（高K’值）以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线。
使用保护柱，如有必要，在进样之间或在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子。
9、使用循环溶剂，但检测器未调整
重新设定基线。当检测器动力学范围发生变化时，使用新的流动相。
10、检测器没有设定在最大吸收波长处
将波长调整至最大吸收波长处
13基线噪音（规则的）
原因和解决方法
1、在流动相、检测器或泵中有空气
流动相脱气。冲洗系统以除去检测器或泵中的空气。
2、漏液
检查管路接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要，更换泵密封。
3、流动相混合不完全
用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂
4、温度影响（柱温过高，检测器未加热）
减少差异或加上热交换器
5、在同一条线上有其他电子设备
断开LC、检测器和记录仪，检查干扰是否来自于外部，加以更正。
6、泵振动
在系统中加入脉冲阻尼器
14基线噪音
原因和解决方法
1、 漏液
检查接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要，更换密封。检查流通池是否漏液。
2、流动相污染、变质或由低质溶剂配成
检查流动相的组成。
3、流动相各溶剂不相溶
选择互溶的流动相
4、检测器/记录仪电子元件的问题
断开检测器和记录仪的电源，检查并更正。
5、系统内有气泡
用强极性溶液清洗系统
6、检测器内有气泡
清洗检测器，在检测器后面安装背景压力调节器
7、流通池污染
（即使是极少的污染物也会产生噪音。）
用1N的硝酸（不能用磷酸）清洗流通池
8、检测器灯能量不足
更换灯
9、色谱柱填料流失或阻塞
更换色谱柱
10、流动相混合不均匀或混合器工作不正常
维修或更换混合器，在流动相不走梯度时，建议不使用泵的混合装置
15宽峰
原因和解决方法
1、流动相组成变化
重新制备新的流动相
2、流动相流速太低
调节流速
3、漏液（特别是在柱子和检测器之间）
检查接头是否松动、泵是否漏液、是否有盐析出以及不正常的噪音。如果必要更换密封。
4、检测器设定不正确
调整设定
5、柱外效应影响
a、柱子过载
b、检测器对反应时间或池体积响应过大
c、柱子与检测器之间的管路太长或管路内径太大
d、记录仪响应时间太长
6、缓冲液浓度太低
增加浓度
7、保护柱污染或失效
更换保护柱
8、色谱柱污染或失效，塔板数较低
更换同样类型的色谱柱。如果新柱子可以提供对称的色谱峰，则用强溶剂冲洗旧柱子。
9、柱入口塌陷
打开柱入口，填补塌陷或更换柱子
10、呈现两个或多个未被完全分离的物质的峰
选择其它类型的色谱柱以改善分离效果
11、柱温过低
提高柱温。除非特殊情况，温度不宜超过75℃
12、检测器时间常数太大
使用较小的时间常数
16分离度降低
原因和解决方法
1、流动相污染或变质（引起保留时间变化）
重新配置流动相
2、保护柱或分析柱阻塞
去掉保护柱进行分析。如果必要则更换保护柱。如果分析柱阻塞，可进行反冲。如果问题仍然存在色谱柱可能被强保留的污染物损坏，建议使用恰当的再生程序。如果问题仍然存在，进口可能阻塞了，更换入口处的筛板或更换色谱柱。
17所有的峰面积都太小
原因和解决方法
1、检测器衰减设定过高
减少衰减的设定
2、检测器时间常数设定太大
设定较小的时间常数
3、进样量太少
增大进样量
4、记录仪连接不当
使用正确的连接
18所有的峰面积都太大
原因和解决方法
1、检测器衰减设定过低
采取较大的衰减
2、进样过多
减少进样量
3、记录仪连接不正确
正确连接记录仪
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