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荧光显微镜检测原理及方法 显微镜技术指标

时间:2020-07-30    来源:仪多多仪器网    作者:仪多多商城     
荧光显微镜检测方法

一、荧光显微镜

荧光显微镜是免疫荧光细胞化学的基本工具。它是由光源、滤板系统和光学系统等主要部件组成。是利用一定波长的光激发标本发射荧光,通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧光图像(图1)。

(一)光源

现在多采用200W的超高压汞灯作光源,它是用石英玻璃制作,中间呈球形,内充一定数量的汞,工作时由两个电极间放电,引起水银蒸发,球内气压迅速升高,当水银完全蒸发时,可达50~70个标准大气压力,这一过程一般约需5~15min。超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子不断解离和还原过程中发射光量子的结果。它发射很强的紫外和蓝紫光,足以激发各类荧光物质,因此,为荧光显微镜普遍采用。


图1 荧光显微镜的结构和主要部件

超高压汞灯也散发大量热能。因此,灯室必须有良好的散热条件,工作环境温度不宜太高。

新型超高压汞灯在使用初期不需高电压即可引燃,使用一些时间后,则需要高压启动(约为15000V),启动后,维持工作电压一般为50~60V,工作电流约4A左右。200W超高压汞灯的平均寿命,在每次使用2h的情况下约为200h,开动一次工作时间愈短,则寿命愈短,如开一次只工作20min,则寿命降低50%。因此,使用时尽量减少启动次数。灯泡在使用过程中,其光效是逐渐降低的。灯熄灭后要等待冷却才能重新启动。点燃灯泡后不可立即关闭,以免水银蒸发不完全而损坏电极,一般需要等15min。由于超高压汞灯压力很高,紫外线强烈,因此灯泡必须置灯室中方可点燃,以免伤害眼睛和发生爆炸时造成操作。

超高压汞灯(100W或200W)光源的电路和包括变压、镇流、启动几个部分。在灯室上有调节灯泡发光中心的系统,灯泡球部后面安装有镀铝的凹面反射镜,前面安装有集光透镜。
国产超高压汞灯GCQ-200型性能良好,可以代替HBO-200等型的进口灯泡,平均寿命在200h以上,价格也比较低。

我国研制的一种简易轻便型高色温溴钨荧光光源装置,体积小,重量轻,功率小,交、直流两用(自带直流电源),易于携带,使用方便,已推广应用。

(二)滤色系统

滤色系统是荧光显微镜的重要部位,由激发滤板和压制滤板组成。滤板型号,各厂家名称常不统一。滤板一般都以基本色调命名,前面字母代表色调,后面字母代表玻璃,数字代表型号特点。如德国产品(Schott)BG12,就是种蓝色玻璃,B是蓝色的第一个字母,G是玻璃的第一个字母;我国产品的名称已统一用拼音字母表示,如相当于BG12的蓝色滤板名为QB24,Q是青色(蓝色)拼音的第一个字母,B是玻璃拼音的第一个字母。不过有的滤板也可以透光分界滤长命名,如K530,就是表示压制滤长530nm以下的光而透过530nm以上的光。还有的厂家的滤板完全以数字命名,如美国Corning厂的NO:5-58,即相当于BG12。

用于荧光显微镜的主要滤板如表1。

表1 荧光显微镜常用滤板型号和透光特点

基本色调相应名称2mm厚透光范围(峰值)nm
上海电器元件厂德国(Schott)苏联日本
黑紫ZWB-1UG-1yΦC-2DV-1300~400(365)
黑紫ZWB-2UG-5yΦC-1-280~240(360)
靛蓝ZB-2BG-1ΦC-1BG-1300~500(380)
靛蓝ZB-3BG-3CC-4BG-3260~520(400)
靛蓝QB-24BG-12CC-8BG-12310~570(420)
淡蓝QB-10BG-38C3C-5-310~720(460)
-QB-12--8--
----11--
橙黄CB-3OG-1(K530)OC-11OG-1530以上
橙黄JB-8OG-4(K510)ЖC-18FY-5510以上
绿橙JB-7GG-11(K490)ЖC-17FY-3480以上
----FY-4-
淡绿JB-4GG-3(K430)жC-11US-10420以上

1.激发滤板 根据光源和荧光色素的特点,可选用以下三类激发滤板,提供一定波长范围的激发光。

紫外光激发滤板:此滤板可使400nm以下的紫外光透过,阻挡400nm以上的可见光通过。常用型号为UG-1或UG-5,外加一块BG-38,以除去红色尾波。

紫外蓝光激发滤板:此滤板可使300~450nm范围内的光通过。常用型号为ZB-2或ZB-3,外加BG-38。

紫蓝光激发滤板:它可使350~490nm的光通过。常用型号为QB24(BG12)。

最大吸收峰在500nm以上者的荧光素(如罗达明色素)可用蓝绿滤板(如B-7)激发。

近年开始采用金属膜干涉滤板,由于针对性强,波长适当,因而激发效果比较玻璃滤更好。如西德Leitz厂的FITC专用KP490滤板和罗达明的S546绿色滤板,均远比玻璃滤板效果好。

激发滤板分薄厚两种,一般暗视野选用薄滤板,亮视野荧光显微镜可选用厚一些。基本要求是以获得明亮的荧光和可以的背景为准。

2.压制滤板 压制滤板的作用是完全阻挡激发光通过,提供相应滤长范围的荧光。与激发滤板相对应,常用以下3种压制滤板:

紫外光压制滤板:可通过可见光、阻挡紫外光通过。能与UG-1或UG-5组合。常用GG-3K430或GG-6 K460。

紫蓝光压制滤板:能通过510nm以上滤长的荧光(绿到红),能与BG-12组合。通常用OG-4 K510或OG-1 K530。

紫外紫光压制滤板:能通过460nm以上波长的荧光(蓝到红),可与BG-3组合,常用OG-11 K470AK 490,K510。

(三)反光镜

反光镜的反光层一般是镀铝的,因为铝对紫外光和可见光的蓝紫区吸收少,反射达90%以上,而银的反射只有70%;一般使用平面反光镜。

(四)聚光镜

专为荧光显微镜设计制作的聚光器是用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成。分明视野聚光器的暗视野聚光器两种。还有相差荧光聚光器。

1.明视野聚光器 在一般荧光显微镜上多用明视野聚光器,它具有聚光力强,使用方便,特别适于低、中倍放大的标本观察。

2.暗视野聚光器

暗视野聚光器在荧光显微镜中的应用日益广泛。因为激发光不直接进入物镜,因而除散射光外,激发光也不进入目镜,可以使用薄的激发滤板,增强激发光的强度,压制滤板也可以很薄,因紫外光激发时,可用无色滤板(不透过紫外)而仍然产生黑暗的背景。从而增强了荧光图像的亮度和反衬度,提高了图像的质量,观察舒适,可能发现亮视野难以分辨的细微荧光颗粒。

3.相差荧光聚光器

相差聚光器与相差物镜配合使用,可同时进行相差和荧光联合观察,既能看到荧光图像,又能看到相差图像,有助于荧光的定位准确。一般荧光观察很少需要这种聚光器。

(五)物镜

各种物镜均可应用,但可以用消色差的物镜,因其自体荧光极微且透光性能(波长范围)适合于荧光。由于图像在显微镜视野中的荧光亮度与物镜镜口率的平方成正比,而与其放大倍数成反比,所以为了提高荧光图像的亮度,应使用镜口率大的物镜。尤其在高倍放大时其影响非常明显。因此对荧光不够强的标本,应使用镜口率大的物镜,配合以尽可能低的目镜(4×,5×,6.3×等)。

(六)目镜

在荧光显微镜中多用低倍目镜,如5×和6.3×。过去多用单筒目镜,因为其亮度比双筒目镜高一倍以上,但目前研究型荧光显微镜多用双筒目镜,观察很方便。

(七)落射光装置

新型的落射光装置是从光源来的光射到干涉分光滤镜后,波长短的部分(紫外和紫蓝)由于滤镜上镀膜的性质而反射,当滤镜对向光源呈45。倾斜时,则垂直射向物镜,经物镜射向标本,使标本受到激发,这时物镜直接起聚光器的作用。同时,滤长长的部分(绿、黄、红等),对滤镜是可透的,因此,不向物镜方向反射,滤镜起了激发滤板作用,由于标本的荧光处在可见光长波区,可透过滤镜而到达目镜观察,荧光图像的亮度随着放大倍数增大而提高,在高放大时比透射光源强。它除具有透射式光源的功能外,更适用于不透明及半透明标本,如厚片、滤膜、菌落、组织培养标本等的直接观察。近年研制的新型荧光显微镜多采用落射光装置,称之为落射荧光显微镜。

二、荧光显微镜标本制作要求

(一)载玻片

载玻片厚度应在0.8~1.2mm之间,太厚的坡片,一方面光吸收多,另一方面不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁,厚度均匀,无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。

(二)盖玻片

盖玻片厚度在0.17mm左右,光洁。为了加强激发光,也可用干涉盖玻片,这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用的物质(如氟化镁)的盖玻片,它可以使荧光顺利通过,而反射激发光,这种反射的激发光女可激发标本。

(三)标本

组织切片或其他标本不能太厚,如太厚激发光大部分消耗在标本下部,而物镜直接观察到的上部不充分激发。另外,细胞重迭或杂质掩盖,影响判断。

(四)封裱剂

封裱剂常用甘油,必须无自发荧光,无色透明,荧光的亮度在pH8.5~9.5时较亮,不易很快褪去 。所以,常用甘油和0.5mol/L pH9.0~9.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂。

(五)镜油

一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时,必须使用镜油,可以使用特制的无荧光镜油,也可用上述甘油代替,液体石蜡也可用,只是折光率较低,对图像质量略有影响。

三、使用荧光显微镜的注意事项

(1)严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作,不要随意改变程序。
(2)应在暗室中进行检查。进入暗室后,接上电源,点燃超高压汞灯5~15min,待光源发出强光稳定后,眼睛完全适应暗室,再开始观察标本。
(3)防止紫外线对眼睛的损害,在调整光源时应戴上防护眼镜。
(4)检查时间每次以1~2h为宜,超过90min,超高压汞灯发光强度逐渐下降,荧光减弱;标本受紫外线照射3~5
min后,荧光也明显减弱;所以,较多不得超过2~3h。
(5)荧光显微镜光源寿命有限 ,标本应集中检查,以节
省时间,保护光源。天热时,应加电扇散热降温,新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再用时,须待灯泡充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。
(6)标本染色后立即观察,因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存,可延缓荧光减弱时间,防止封裱剂蒸发。
(7)荧光亮度的判断标准:一般分为四级,即“一”—无或可见微弱荧光。“+”—仅能见明确可见的荧光。“++”—可见有明亮的荧光。“+++”—可见耀眼的荧光。

四、荧光图像的记录方法

荧光显微镜所看到的荧光图像,一是具有形态学特征,二是具有荧光的颜色和亮度,在判断结果时,必须将二者结合起来综合判断。结果记录根据主观指标,即凭工作者目力观察。作为一般定性观察,基本上可靠的。随着技术科学的发展,在不同程度上采用客观指标记录判断结果,如用细胞分光光度计,图像分析仪等仪器。但这些仪器记录的结果,也必须结合主观的判断。

荧光显微镜摄影技术对于记录荧光图像十分必要,由于荧光很易褪色减弱,要即时摄影记录结果。方法与普通显微摄影技术基本相同。只是需要采用高速感光胶片如ASA200以上或24。以上。因紫外光对荧光猝灭作用大,如FITC的标记物,在紫外光下照射30s,荧光亮度降低50%。所以,曝光速度太慢,就不能将荧光图像拍摄下来。一般研究型荧光显微镜都有半自动或全自动显微摄影系统装置。



    1、如何正确安装显微镜?

    显微镜镜头的目镜和物镜在未使用前室没有安装的,因此,每次使用显微镜前,先要显微镜镜头目镜和物镜安装上往。显微镜目镜的安装并不难,关键是安装显微镜的物镜,确保物镜安装的正确。由于物镜价格昂贵,为确保安全,建议在安装显微镜镜头物镜时要用左手食指和中指托住,然后用右手将物镜装上往,这样即使没安装好,也不会摔到地上。

    2、显微镜镜头如何正确对光?

    对光是使用显微镜时很重要的一步,对光并不是随便转一个物镜对着通光孔就行,一定要用低倍镜对光,当光线较强时用小光圈、平面镜,而光线较弱时则用大光圈、凹面镜,反光镜要用双手转动,当看到均匀光亮的圆形视野为止。光对好后不要再随便移动显微镜,以免光线不能正确地通过反光镜进进通光孔。

    3、如何正确使用显微镜镜头准焦螺旋?

    使用准焦螺旋调节焦距,找到物象可以说是显微镜使用中较为重要的一步。千万不要在操纵中出现以下错误:一是在高倍镜下直接调焦;二是不管镜筒上升或下降,眼睛始终在往目镜中看视野;三是不了解物距的临界值,物距调到2~3厘米时还在往上调,而且转动准焦螺旋的速度很快。前两种错误结果往往造成显微镜镜头物镜镜头抵触到装片,损伤装片或镜头,而第三种错误则是学生使用显微镜时较为常见的一种现象。调节焦距一定要在低倍镜下调,先转动粗准焦螺旋,使镜筒慢慢下降,物镜靠近载玻片,但留意不要让显微镜镜头物镜碰到载玻片,在这个过程中眼睛要从侧面看物镜,然后用左眼朝目镜内注视,并慢慢反向调节粗准焦螺旋,使镜筒渐渐上升,直当看到物像为止,同时一般显微镜的物距在1厘米左右,所以假如物距已远超过1厘米,但仍未看到物像,那可能是标本未在视野内或转动粗准焦螺旋速度过快,此时应调整装片位置,然后再重复上述步骤,当视野中出现模糊的物像时,就要换用细准焦螺旋调节,只有这样,才能缩小寻找范围,进步找到物像的速度。

    4、显微镜镜头物镜如何转换?

    使用低倍镜后换用高倍镜,不用手指直接推转显微镜镜头物镜,由于这样轻易使物镜的光轴发生偏斜,原因是转换器的材料质地较软,精度较高,显微镜镜头螺纹受力不均匀很轻易松脱。一旦螺纹破坏,整个转换器就会报废。正确操纵室手握转换器的下层转动板转换物镜。







    金相显微镜是专门用于观察金属和矿物等不透明物体金相组织的显微镜镜,它具有稳定性好、成像清晰、分辨率高、视场大而平坦的特点。


    因其对被测物进行既定性又定量地进行分析,故对金相显微镜的校准工作必不可少。

 


    金相显微镜的校准:


    为了提高我国的材料研发制造水平,我们必须对金相显微镜进行校准或检定。金相显微镜主要分为光学式金相显微镜、数码金相显微镜、便携式视频金相显微镜、万能金相显微镜、图像分析仪等。


    1、金相显微镜的溯源由于各种金相显微镜的用途不同,故其类型、结构及精度亦不同,因而溯源关系和方式也不同。通过不同的技术手段和方法,我们最终可溯源到“单刻线样板标准器组”和“0.01mm标准测微尺”标准器组。


    2、金相显微镜校准项目的设立


    (1)物镜场曲将一物镜安装好,将0.01mm标准测微尺放在工作台上并压紧;旋转调焦旋钮,将焦点调整在测微尺的中间,视场中心成像清晰,此时将千分表测头与工作台表面相接触并对好表的零位;


    再次旋转调焦旋转,把焦点调整到测微尺的边缘,使视场边缘成像清晰。


    观察千分表,其最大偏移量即为该物镜的场曲误差,其余物镜以此类推进行校准。物镜场曲误差的指标如下:10X<0.2mm、25X<0.1mm、40X<0.07mm、63X<0.065mm、100X<0.04mm


    (2)物镜放大倍数的正确性装上10X标准目镜和被检物镜,将0.01mm标准没微尺放在工作台上并压紧。观察时测微尺应与目镜中的分划板相符合,其偏移量测是放大倍数的误差。其余物镜以此类推进行校校准,其误差不大于5%


    (3)目镜分划板的准确度将带分划板目镜的镜头旋下,把分划板放置在万工显工作台上并调好焦距;调整工作台,使分划板的水平线与万工显纵向导轨行程平行并对好零位,按每20格测量一次,直到第100格,其误差不大于5um


    (4)物镜成像清晰范围用被检物镜及10X目镜对测微尺或金相试样进行调焦,使成像清晰。当视场中心像清晰时,测得视场内的成像清晰范围的误差不低于60%


    (5)各物镜相对于目镜的格值装上被检仪器的10X目镜,将0.01mm标准测微尺(推荐使用随机0.01mm测微尺)放在工作台上并压紧;


    调整测微尺标尺轴线与仪器目镜分划板标尺轴线平行,并读出目镜分划板i条刻线里包含测微尺n条刻线数,该物镜相对于目镜的格值为:C=n/i*0.01mm.其余物镜的格值以此类推进行校准。


    金相显微镜是是广泛用于冶金、机械加工、科技等行业的测量仪器。它可以测量金属材料金相组织奥氏体的晶粒度级别、材料热处理后渗碳层的厚度等。







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