分光光度计测定总胆碱的方法 光度计是如何工作的

1. 原理食物中的胆碱经过处理提取后，通过Florisil柱色谱纯化，然后用雷纳克盐（Reineckate）与胆碱反应形成粉红色的胆碱－雷纳克盐复合物，这种复合物被丙酮洗脱后，在526nm有最大吸收，其吸收值与胆碱浓度成正比。

2. 适用范围参照Methods of Vitamin Assay，适用于各类食物中胆碱的测定。

3. 仪器与设备（1）实验室常用设备。（2）回流提取装置。（3）色谱柱：为0.8cm（内径）×30cm的玻璃柱，柱上端为体积30～50mL的贮液池，底端收缩变细，并装有活塞。活塞上约1cm处有一玻璃筛板，筛板孔径为16～30μm。（4）分光光度计。

4. 试剂除特殊说明外，所有试剂均为分析纯，实验用水为蒸馏水。（1）甲醇。（2）氯仿。（3）乙酸甲酯。（4）丙酮：用前重蒸馏。（5）10％丙酮：取50mL丙酮溶解于450mL水中。（6）冰乙酸。（7）冰乙酸－甲醇溶液：取50mL冰乙酸和40mL甲醇混合。（8）饱和氢氧化钡提取液：于1000mL甲醇中加入40g无水Ba（OH）2，搅拌10min，再加入100mL氯仿，混合，使Ba（OH）2饱和，过滤去除多余的Ba（OH）2。（9）硅镁吸附剂（Florisil）：Sigma公司，60～100目。（10）雷纳克铵（Ammonium Reineckate）饱和溶液：称取2～3g雷纳克铵，加入100mL水中，搅拌10min，过滤去除多余的雷纳克铵。实验当日配制。（11）胆碱标准贮备液（5g/L）：准确称取无水氯化胆碱0.57613g，溶解于水中，并定容至100mL。冰箱保存。（12）胆碱标准工作液（1g/L）：准确吸取2.0mL标准贮备液，用水稀释定容至100mL。

5. 测定步骤所有操作均需避光进行。（1）提取：称取适量样品（约含5～50mg胆碱），置于100mL具塞锥型瓶中，加入30mL提取液，边加边摇，避免结块。然后放置于76～80℃恒温水浴回流2～4h，回流速度为1～2滴/s[注意：加热回流的温度应严格控制在80℃左右，否则样品易扑溅，造成损失。样品提取率与回流时间有关，回流2h，提取率达到最高值，回流3～4h，可以保证样品提取较完全]。冷却，样品过滤至100mL容量瓶中，反复用5～10mL冰乙酸－甲醇溶液洗涤锥形瓶和滤渣，滤液并入容量瓶中。用pH试纸测定提取液pH在2～6范围之内[注意：必要的话可加入冰乙酸调节pH]，然后用甲醇定容至刻度。（2）纯化：
① 填装色谱柱：将硅镁吸附剂浸入甲醇中，湿法将硅镁吸附剂填充入色谱柱中[注意：色谱柱可以经过干燥处理，否则影响洗脱液流速]，至硅镁吸附剂的高度达10cm（约4g）。用甲醇冲洗色谱柱，并保持甲醇高于硅镁吸附剂顶端0.5～1cm。
② 色谱柱纯化：吸取一定量的提取液回到色谱柱中，打开底端活塞，使提取液靠重力作用通过色谱柱。先后用5、10mL甲醇洗涤色谱柱。待甲醇通过色谱柱后，依次用2份10mL乙醇甲酯，10mL冷的10％丙酮洗涤色谱柱。接着加入5mL雷纳克铵饱和溶液[注意：雷纳克铵与吸附于色谱柱上的胆碱结合]，待雷纳克铵饱和溶液完全通过色谱柱后，用2份10mL冰乙酸洗涤直至流出液清亮炎止[注意：冰乙酸的作用是洗脱未与胆碱结合的过量的雷纳克铵，应注意洗脱安全]。用15mL丙酮洗脱色谱柱上胆碱－雷纳克盐复合物的粉红色色谱带，收集洗脱液，并用丙酮定容至15mL。（3）比色测定：用1cm比色杯，以丙酮调节零点，于526nm波长下，测定样品吸光度，其值在标准工作曲线上查出，或通过回归方程计算出对应的胆碱含量，供计算使用。（4）标准工作曲线：分别吸取0.50、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL标准工作液，加至色谱柱上，按照上述样品测定步骤操作。以胆碱含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程。

6. 结果计算
式中 x——样品中胆碱的含量，mg/100g；
m1——从标准工作曲线或回归方和中查到的胆碱含量，mg；
V1——样品提取液的总体积，mL；
V2——纯化用提取液的体积，mL；
m——样品质量，g。

7. 结果的允许差同一实验室平行测定或重复测定结果的相对偏差绝对值＜10％。

8. 注意事项（1）硅镁吸附剂填充的高度关系到洗脱液的用量，如果填充过高，则应加大洗脱液用量，以保证胆碱的纯化和完全洗脱。（2）纯化过程中冰乙酸的作用是将不能与胆碱形成复合物的多余雷纳克铵盐洗脱，丙酮则是洗脱胆碱－雷纳克铵复合物，如果这两步洗脱不完全，均影响胆碱的测定，所以必要时应增加冰乙酸和丙酮的用量以保证测定结果。