微生物数量的测定——显微镜直接计数法！
细菌群体生长表现为细胞数目的增加或细胞物质的增加。测定细胞数目的方法有显微镜直接计数法(direct microscopic count)、平板菌落计数法(plate count)、光电比油法(turbidityestimation by spectrophotometer)、最大或然数法(most probable number MPN)以及膜过滤法(membrane filtration)等。测定细胞物质的方法有细胞干重的测定，细胞某种成分如氮的含量、RNA 和DNA 的含量测定，代谢产物的测定等。总之，测定微生物生长量的方法很多，各有优缺点，工作中应根据具体情况要求加以选择。本实验主要介绍生产、科研工作中比较常用的显微镜直接计数法。
一、目的要求
1、明确血细胞计数板计数的原理。
2、掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。
二、基本原理
显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上(又称计菌器)，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。目前国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser 计菌器以及Hawksley 计菌器等，它们都可用于酵母、细菌、霉菌孢子等悬液的计数，基本原理相同。后两种计菌器由于盖上盖玻片后，总容积为0.02mm3，而且盖玻片和载波片之间的距离只有0.02mm，因此可用油浸物镜对细菌等较小的细胞进行观察和计数。除了用这些计菌器外，还有在显微镜下直接观察涂片面积与视野面积之比的估算法，此法一般用于牛乳的细菌学检查。显微镜直接计数法的优点是直观、快速、操作简单。但此法的缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和。目前已有一些方法可以克服这一缺点，如结合活菌染色微室培养（短时间）以及加细胞分裂抑制剂等方法来达到只计数活菌体的目的。
本实验以血球计数板为例进行显微镜直接计数。另外两种计菌器的使用方法可参看各厂商的说明书。用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。该计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各列有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室。血细胞计数板构造如图l5-1。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成25 个中方格，而每个中方格又分成16 个小方格(图15-2)；另一种是一个大方格分成16 个中方格，而每个中方格又分成25 个小方格，但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400 个。每一个大方格边长为lmm，则每一个大方格的面积为lmm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.lmm，所以计数室的容积为0.lmm3(万分之一毫升)。图15—1 血细胞计数板构造（一） 图15—2 血细胞计数板构造（二）A. 正面图；B.纵切面图； 放大后的方格网，中间大方格为计数室1.血细胞计数板；2. 盖玻片；3.计数室计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上25 或16，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成lml 菌液中的总菌数。设五个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数为B，如果是25 个中方格的计数板，则1mL 菌液中的总菌数=A/5×25×104×B=50000A·B（个）同理，如果是16 个中方格的计数板，1mL 菌液中的总菌数=A/5×16×104×B=32000A·B（个）
三、器材
1、菌种
酿酒酵母
2、仪器或其他用具
血细胞计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细滴管。
四、操作步骤
1、菌悬液制备
以无菌生理盐水将酿酒酵母制成浓度适当的菌悬液。
2、镜检计数室
在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗，吹干后才能进行计数。
3、加样品
将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的酿酒酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，一般计数室均能充满菌液。取样时先要摇匀菌液；加样时计数室不可有气泡产生。
4、显微镜计数
加样后静止5min，然后将血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。调节显微镜光线的强弱适当，对于用反光镜采光的显微镜还要注意光线不要偏向一边，否则视野中不易舌清楚计数室方格线，或只见竖线或只见横线。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有5~10 个菌体为宜。每个计数室选5 个中格(可选4 个角和中央的一个中格)中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作为两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算样品的含菌量。
5、清洗血细胞计数板
使用完毕后，将血细胞计数板在水龙头用水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。
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关于如何购买生物显微镜，对于一些接触过显微镜的人来说还是比较容易的，但是对于一些新接触显微镜的客户来说是比较难的，为了不让客户走弯路，直接买到合适自己使用的显微镜，下面我们来介绍下具体购买显微镜的基本过程，和需要注意的几个因素，这样的选购的时候就不会那么迷茫了。
1.要选择自己合适的生物显微镜，主要是看自己拿来看什么的，怎么样看都需要什么，，什么样品，透光不透光等
2.选好生物显微镜以后，就要选择外观了，这里的外观不是说仪器的美观程度，而是你在看试样的时候方便程度，你要看标准试样还是看不规则试样，此点很重要，标准试样就用正置的，不规则的就倒置的。总所周知，正置显微镜物镜和载物台的距离是规定了的，也即是说选了这类仪器以后，不管你愿意不愿意，都要把试样做成标准的那种，否则你看不到试样的，倒置的就不同了，你只需要把要看的那个面磨平就可以看了
2.显微镜功能：您如果只要求单一的明场，一个简单的仪器就可以满足您的要求，如果您还需要暗场，或者相称这些功能，都要把他考虑进去，把他写到仪器采购要求里面，这样买过来的仪器才好用，要不会很麻烦的。
3.效果，显微镜分单目，双目，和三目。如何买到合适的生物显微镜
当然，并不是说三目的需要用三只眼睛看，也是用两只眼睛，但是三目的目的是可以连接成像系统，和电脑、电视或者显示器连接，三目的多用于工厂检测、实验室、学校老师教学用，单目的比较适合学生用如何买到合适的生物显微镜
5.价格.服务.售后：这些也是比较重要的如何买到合适的生物显微镜
价格要货比三家，确定是同样的东西，同样的配置，然后再看价钱，看服务，看售后
试问，客户拿钱去买东西，遇到的却是不冷不热的待遇，或者遇到没有保障的商家，谁还愿意拿钱去买他家东西，就算买回来，在以后的售后问题上还不知道会出什么样的事情
对于确实不懂的客户，可先和销售联系，了解一些基本的东西，然后在根据自己的需求来选择，选择好以后，再找技术来核实一下看合适不合适，这样你才能够真正的了解显微镜。否则买回来也不怎么好用。
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