原代培养的细胞会不可避免地存留少量异质细胞一同生长.为了后续实验结果的针对性和准确性,一般都需要对培养物进行纯化。纯化神经元的方法有很多种,简便及常用的是采用有丝分裂抑制剂阿糖胞苷来抑制异质细胞的存活和生长。神经元的分化增殖完成于胚胎期,大部分神经元在出生后即为分裂后细胞,但其他细胞则仍然不断地进行分裂增殖,使用有丝分裂抑制剂后,非神经元的细胞生长会受到抑制及淘汰,神经元由此得到纯化实验材料:Hanks液,DMEM培养基10ml,有刻度吸管两只,弯头吸管两只,无刻度吸管一只,新生乳鼠(24小时)0.05%胰酶,1%双抗,10%胎牛血清,培养皿,小烧杯,空的离心管,镊子,剪刀,酒精灯,酒精棉,实验前准备工作:肥皂洗手,新吉尔灭擦手,开通风柜,将吸管从套筒中取出放入各自对应的试管内,将橡皮塞安装到各自吸管上,酒精灯分别迅速灼烧,1配液Hanks液近40ml加1%双抗1ml,加完双抗的小吸管留作计数,在DMEM培养基中加10%胎牛血清(已配好,全部加入),从离心管取一滴碳酸氢钠调节pH值至溶液呈紫色,一离心管0.05%胰酶,
取材。乳鼠新生24小时。3,洗涤剪碎,在培养皿中加入少许Hanks液洗涤,将乳鼠头部用酒精棉擦拭消毒,在乳鼠头部位置剪一个工字型切口,将皮肤颅骨沿着切口依次剪开剥离,取出大脑组织,并去除乳鼠的血管脑膜,用弯头吸管将Hanks液与剥离干净的脑组织移走到另一个干净的培养皿中,用弯头吸管洗走洗液,弯头吸管将含有脑组织的Hanks移入到小烧杯中剪碎,每个组织块近似一立方毫米,静置后洗走上面的Hanks液,(吸取Hanks液时勿将下面的组织块洗走),同样方法再用Hanks液洗涤一次4.酶解,加一离心管0.05%胰酶,将上述小烧杯中的组织液移入空置的离心管中,37摄氏度水浴10分钟,观察组织块是否变小,静置2分钟,使组织沉淀下来,弃掉上请胰酶后,加DMEM培养基(全部倒入)来中和胰酶,吹散组织液5.离心1200转每分钟,离心5分钟,弃掉上清液,沉淀后加Hanks液吹散重悬组织液,用同样的转速和时间在离心一次,加完全培养基3-4mL吹散,静置1分钟,以便消化大块组织6.计数,取0.1ml离心后的细胞液加入苔盘蓝染色,加样抢加0.1微升与计数板计数,同时剩余细胞液加入培养瓶中进行培养接种,标注好组别和时间,培养细胞的名称37摄氏度,二氧化碳培养箱中,下周实验课观察细胞培养情况。
二氧化碳培养箱操作使用
1.二氧化碳培养箱应有良好的接地装置,以保证安全。
2.使用中应经常监视减压阀输出压力及二个流量计的流量,切不可随意拧动控制箱内的各类阀门。若二氧化碳培养箱内浓度有偏差,应先找出各相关数值不准的原因,才能略为调整。
3.钢瓶压力不足1Mpa时应及时更换,更换钢瓶时,应先将钢瓶开关关闭,拧松减压阀螺轴,再拆下减压阀重新安装在新的钢瓶上。
4.本机应安装在空气干净、无日光直射、无强电磁场及辐射能量,周围温差变化较小的室内。为保证二氧化碳培养箱控温精度,建议在15℃-25℃的环境下使用。
5.开机前应熟读使用说明书,掌握正确的使用方法,特别注意钢瓶开启前,一定要拧松减压阀,防止输气胶管爆破。
6.当环境温度与设定温度差小于(RT、5℃)时,应用空调降低周围环境温度,在培养的全过程中,应保持环境温度没有明显的变化,否则因环境温度的变化,引起二氧化碳培养箱内控温不准。
7.在打开二氧化碳培养箱内门时,应先关闭二氧化碳控制开关,关门后,待CO2浓度显示屏显示“0.0”时,再打开CO2控制开关。
8.在首次使用本机或长期不用后重新使用本机时,均应按使用方法第1条至第3条要求操作,尤其在正式培养时应作污染检查。
9.在打开玻璃门时,应按使用方法3,进行操作,防止箱内温度和CO2浓度恢复时因累计而产生“过冲”现象。
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