高效液相色谱仪测定氨基酸的含量 液相色谱如何做好保养

            高效液相色谱仪测定氨基酸的含量
1  L--色氨酸含量的测定
1.1 实验仪器与试剂
色氨酸样品，甲醇， STI501液相色谱仪梯度系统，UV501紫外检测器，7725I手动进样阀，N2000色谱工作站，0.03%KH2PO4溶液
1.2 HPLC色谱分析条件
流动相为0.03%KH2PO4溶液（A）-甲醇（B），线性梯度淋洗，流速1.0mL/min，柱温 35℃，检测波长276nm。
流动相 时间（t/min）
 5 10 15 20
A（%） 80 90 80 70
B（%） 20 10 20 30
1.3 标准溶液的配制
精密称取色氨酸标准标准品50mg，置100ml容量瓶中，振摇，用流动相溶解到刻度，作为供试品溶液，另取色氨酸样品适量，同法操作。
1.4 标准直线的制作
精密称取色氨酸标准样品适量 ,分别稀释制成每1ml 中含色氨酸50.0、100.0、200.0、400.0、600.0、800.0、1000.0μg 的溶液，注入液相色谱仪，以色氨酸峰面积A为纵坐标，浓度C为横坐标，制作回归标准直线。
1.5 发酵液中样品中色氨酸含量的测定
取发酵液，稀释配制成约 500μg/ ml 的溶液，摇匀，过滤，取25μl进样，在高效液相色谱仪下测量，记录峰值面积，作图。
2 L-精氨酸含量的测定
2.1 实验仪器与试剂
L-精氨酸标准样品，乙腈， STI501液相色谱仪梯度系统，UV501紫外检测器，7725I手动进样阀，N2000色谱工作站，磷酸二氢铵。
PH计，磷酸，
2.2 　HPLC色谱分析条件
流动相: 以磷酸二氢铵溶液 ( 称取磷酸二氢铵1.15g, 加水800m溶解后, 用磷酸调节pH 值至2.0±0.1, 加水稀释至 1000ml ) - 乙腈为流动相，线性梯度淋洗; 柱温为30℃检测波长为206nm；进样量：25μl。
2.3 标准直线的制作
精密称取精氨酸标准标准品50mg，置100ml 容量瓶中，振摇，用流动相溶解到刻度，作为供试品溶液，另取色氨酸样品适量，同法操作。精密称取精氨酸标准样品适量 ,分别稀释制成每1ml 中含精氨酸50.0、100.0、200.0、400.0、600.0、800.0、1000.0μg 的溶液，注入液相色谱仪，以精氨酸峰面积A为纵坐标，浓度C为横坐标，制作回归标准直线。
2.4 发酵液中样品中精氨酸含量的测定
取发酵液，稀释配制成约 500μg/ ml 的溶液，摇匀，过滤，取25μl 进样，在高效液相色谱仪下测量，记录峰值面积，作图。

3 L-甘氨酸含量的测定
3.1 实验仪器和试剂
    乙酸铵溶液；乙腈；L-甘氨酸标准样品； STI501液相色谱仪梯度系统，UV501紫外检测器，7725I手动进样阀，N2000色谱工作站。
3.2 ＨＰＬＣ色谱分析条件
流动相:A为0.02%mol/L乙酸铵溶液（PH=6.5）:B为乙腈，线性梯度淋洗；流速: 110 mL/min ；柱温:30℃；进样量:２0μL。
梯度洗脱表3
流动相 时间（t/min）
 10 20 30 40 50 60
A（%） 80 60 40 40 60 80
B（%） 20 40 60 60 40 20
3.3 标准直线的制作
方法同2.2节
3.4 发酵液中样品中甘氨酸含量的测定
     方法同2.5节

4 L-甲硫氨酸含量的测定
4.1   实验仪器和试剂
   L-甲硫氨酸标准样品；甲醇；醋酸钠； STI501液相色谱仪梯度系统，UV501紫外检测器，7725I手动进样阀，N2000色谱工作站。
4.2   HPLC色谱分析条件
流动相: A为甲醇 , B为 50 mmol /L的醋酸钠缓冲溶液;流速1 . 0 mL /min;梯度洗脱见表1，测定波长为 262 nm，柱温为30℃。
梯度洗脱表4
流动相                 时间（t/min）
 10 20 30 40 50 60
A（%） 30 50 80 85 100 100
B（%） 70 50 20 15 0 0
4.3   标准直线的制作
方法同2.2节
4.4   发酵液中样品中甲硫氨酸含量的测定
     方法同2.5节
5 回收率实验
　 称取甘氨酸标准液50μg/ml分别稀释0、1、2、4、6、8、10倍，每份取1ml，按标准样品处理方法，过滤，测定标准样品中的甘氨酸的含量，计算回收率。

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　　液相色谱仪根据固定相是液体或是固体，又分为液-液色谱(LLC）及液-固色谱(LSC）。现代液相色谱仪由高压输液泵、进样系统、温度控制系统、色谱柱、检测器、信号记录系统等部分组成。与经典液相柱色谱装置比较，具有、快速、灵敏等特点。　　
　　液相色谱仪19个常见故障的排除方法：
　　
　　1.操作过程若发现压力很小，则可能管件连接有漏，注意检查。当出现错误警告(各组件指示灯均为红色)，一般为漏液，其中一个感应器中已有溶剂，漏液故障排除后，擦干，点击Online操作界面中的Instrument/SystemOff，然后再点击操作界面中的Instrument/SystemOn即可；
　　
　　2.连接柱子与管线时，应注意拧紧螺丝的力度，过度用力可导致连接螺丝断裂。柱接头处易发生漏液，可能情况为接头Fittings中间的管子未和接口处贴紧。不同厂家的管线及色谱柱头结构有差异，不要混用，必要时可使用PEEK管及活动接头；
　　
　　3.操作过程若发现压力非常高，则可能管路已堵，应先卸下色谱柱，然后用分段排除法检查，确定何处堵塞后解决。若是保护柱或色谱柱堵塞，可用小流量流动相或以小流量异丙醇冲洗，还可采用小流量反冲的办法(新柱不提倡)，若还是无法通畅，则需换柱；
　　
　　4.运行过程中自动停泵，可能为压力超过上限或流动相用完；
　　
　　5.样品瓶中样品较少，自动进样器进样针无法到达液面，可采用调低进样针进样高度的办法，注意设置时不要使进样针碰到瓶底，微量样品分析应使用微量样品瓶；
　　
　　6.自动进样器进样针未与样品瓶瓶口对准时，需重新定位；
　　
　　7.泵压不稳或流量不准，可能为柱塞杆密封圈问题或sealwash垫圈问题，需更换；
　　
　　8.基线产生不规则噪声，可能原因为系统不稳定或没达到化学平衡(使其平衡，若用离子对试剂，在使用使需要足够的时间和溶剂体积，色谱柱才能达到足够的平衡)，流动相被污染(更换流动相，清洗储液器、过滤器，冲洗并重新平衡系统)，色谱柱被污染(为证明可能的原因更换系统的色谱柱或使用一根同类的被证明性能好的色谱柱)，检测器不稳定；
　　
　　9.短期有规则的噪声，可能原因为泵压不稳或泵脉冲，调节溶剂不适当(如，两种溶剂的互溶性问题)，泵入口管路松或堵塞，泵太脏，泵柱塞磨损，检测器不稳定；
　　
　　10.长期有规则噪声，可能原因为室温不稳(未使用柱温箱)或使用柱温箱不当；
　　
　　11.基线漂移，可能原因为系统不稳或没有达到化学平衡，室温不稳(未使用柱温箱)，流动相污染或分解，柱污染，检测池泄漏，系统泄漏，固定相流失(另选流动相，另选色谱柱)，测定的波长选择错误(对溶剂有吸收)，样品组分保留太长(用强度合适的溶剂清洗色谱柱)，检测器不稳定；
　　
　　12.每次进样时的保留时间不重复，可能原因为系统不稳或未达到化学平衡，由于气泡、各部件磨损等原因引起的泵压或泵脉冲输液不稳定，进样体积太大或样品浓度太高平衡被破坏，溶剂配比不合适，柱被污染；
　　
　　13.无峰，可能原因为检测器选择错误，使用错误的流动相，样品降解；
　　
　　14.色谱峰比预计的小，可能原因为进样体积错误，检测器灯故障，进样问题(瓶号错、进样体积不合适、进样错误、针头堵塞)；
　　
　　15.峰变宽，可能原因为进样体积太大或样品浓度太高，过滤器、保护柱入口、柱入口或连接管路有部分堵塞，检测器时间常数设置错误，进样器问题(如，阀漏、针头堵塞或损坏)，柱或保护柱被污染，对流动相来说样品溶剂太强，使用错误的色谱柱，温度变化;
　　
　　16.出现双峰/肩峰，可能原因为保护柱或柱入口部分阻塞，柱或保护柱被污染，柱性能下降，保护柱失效，进样体积太大或样品浓度太高(样品过载)，平衡破坏;
　　
　　17.前沿峰，可能原因为进样体积太大或样品浓度太高(样品过载)，平衡破坏，对于流动相来说样品溶剂非极性太强(对于反相柱)，柱或保护柱被污染，柱性能下降，保护柱失效;
　　
　　18.脱尾峰，可能原因为柱或保护柱被污染，柱性能下降，保护柱失效，进样器问题(如，阀漏等)，检测器时间常数设置错误;
　　
　　19.出现鬼峰，可能原因为流动相被污染，样品预处理时产生降解或混入杂质，先前进样的流出物，样品定量管清洗不当，注射器脏，柱被污染，进样装置被污染，流动相中含有稳定剂/稳定剂变化。水膜和油膜的外壳有标示的。

    液相色谱仪的日常操作条件：温度：10-40℃；相对湿度<80％；可以是恒温、恒湿，远离高电干扰、高振动设备，使用后液相色谱仪检测器的保养对液相色谱仪的使用寿命影响至关重要。

    微小的颗粒杂质或薄膜沉积在流通池里，会导致基线噪声的增加或降低灵敏度。此时必须进行清洗处理。一般常规清洗不必拆下流通池，可直接在流通池入口处（即检测器输入端），接上一个专用的注射器接头，依次用去离子水、酒精和3MHNO3冲洗流通池，最后用去离子水反复冲洗数次。检测器出口用玻璃瓶盛接流出的废液。

    若检测器已长期使用或受到高浓度样品的污染，经上述方法还不能除去污垢，就得取下流通池，液相色谱仪检测器的保养按以下步骤拆开进行清洗：

    1)卸下紫外检测器侧面遮盖流通池的盖板，松开固定流通池支架的螺钉，小心地取出流通池支架。

    2)拆下连接流通池输入、输出端的不锈钢导管（或PEEK导管），卸下流通池体。仔细拧下石英窗和透镜的护圈。小心取下垫圈、石英窗、透镜、护圈，放在一个盛有乙醇的烧杯内，用超声波清洗机处理5min~10min。

    3)用蒸馏水、乙醇冲洗流通池，并用超声波清洗，最后用去离子水冲洗数次，除去池内杂物。

    4）烘干各部件（注意：避免用手直接接触透镜及石英窗）。

    5）重新装配流通池体。

    6)按原样装在流通池支架上，并接好导管，并进行试漏。（方法：池体输入端与恒流泵连接，开启恒流泵（流动相用蒸馏水），视各密封点及石英窗口是否有漏液溢出。

    7）装入紫外检测器机箱内，盖上盖板，并用原螺钉、螺帽固定。

    注：上述液相色谱仪检测器的保养拆洗应有经培训过的专业维修人员进行。

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