高效液相色谱测定饲料中盐酸氨丙琳的方法 液相色谱常见问题解决方法

高效液相色谱测定饲料中盐酸氨丙琳的方法
GB/T 8381.11-2005
范围
本标准规定了以高效液相色谱法测定饲料中盐酸氨丙琳的方法，适用于配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料和精料补充料中盐酸氨丙琳的测定，最低检测浓度为1.0 m g/kg.
原理
饲料样品中的盐酸氨丙琳以含有离子对试剂的甲醇溶液超声提取，离心后过滤，用离子对反相液相色谱法测定。
试荆和材料
除特殊注明外，本法所用的试剂均为分析纯，水为蒸馏水，色谱用水符合GB/T 6682一级水的规定。
4.1 乙睛:色谱纯。
4.2 甲醇。
4.3 十二烷基磺酸钠。
4.4 二乙胺。
4.5 冰乙酸。
4.6 提取液:称取1. 36 g十二烷基磺酸钠(4.3),溶于适量2+1(V1+V2)的甲醇水溶液中，并用该混合液稀释至1 L.
4.7 盐酸氨丙琳标准品:纯度99.8%.
4.8 盐酸氨丙琳标准溶液
4.8. 1 盐酸氨丙琳标准储备液:准确称取盐酸氨丙琳标准品(4. 7)0.0500g，置于100mL容量瓶中，用提取液(4. 6)溶解并定容至刻度，摇匀，其浓度为500ug/mL,贮于4--6℃冰箱中，有效期一个月。
4.8.2 盐酸氨丙琳标准工作液:准确吸取盐酸氨丙琳标准储备液(4.8.1)10.00 mL，置于50 mL容量瓶中，用提取液(4.6)溶解并定容至刻度，摇匀，其浓度为100 ug/mL。再以此稀释液配置50 ug/mL,10 ug/mL,5 ug/mL的标准工作液。
4.9 HPLC流动相:称取1.09g 十二烷基磺酸钠(4.3 )，溶于适量体积分数为30%的乙睛水溶液中，加入3 mL二乙胺(4.4)和10 mL冰乙酸(4.5)，用体积分数为30%的乙睛水溶液稀释至I L混匀，用0.45mm滤膜过滤，使用前超声脱气。
5 仪器
分析天平:感量为0.0001g 和0.001g ，各一台。
超声水浴。
离心机:4000r/min-5000r/min,
501高效液相色谱仪:具有紫外检测器或二极管阵列检测器。
6 试样制备
按GB/T 14699.1采取有代表性的样品200g -500g ，用四分法缩至100g ，粉碎，使全部通过0.45mm孔径的筛，充分混匀，贮于磨口瓶中备用。
分析步骤
7.1 提取
称取饲料样品5g(准确至0.0 01g )，置于50m L离心管中，准确加人提取液(4.6)50.00m L，加塞，充分摇动1min，再置超声水浴中超声提取20min，其间用手充分摇动两次。取出后于离心机上4000r/min离心10min，将上清液用0.45um滤膜过滤，滤液作为试样溶液。
7.2 测定
7.2 .1 HPLC测定参数的设定
色谱柱:C18柱，柱长150mm，柱内径4.6mm,粒度5um，Vertex C18分析柱。
柱温 : 室温。
检测器 :紫外检测器，检测波长267nm,
流动相流速:1.5m L/min
进样量 : 10ul-20ul。
7.2.2 定f测定
取 适 量 由7.1获得的试样溶液和相应浓度的盐酸氨丙琳标准工作液(4.8.2)进行测定，以色谱峰峰
面积做单点校准定量。
结果计算与表述
分析结果表示为盐酸氨丙琳在饲料中的质量分数X，以毫克每千克(mg/kg)表示，用式(1)计算:X=P2*V1*c*V2/P1*m*V3……………………(1)
式中:
V1— 加人提取液的体积，单位为毫升(mL) ;
V2 盐酸氨丙琳标准溶液的进样体积，单位为微升(uL);
V3— 试样溶液的进样体积，单位为微升(uL) ;
P1 盐酸氨丙琳标准溶液对应的色谱峰面积响应值;
P2— 试样溶液对应的色谱峰面积响应值;
c— 盐酸氨丙琳标准溶液的浓度，单位为微克每毫升(ug/mL);
m— 试样质量，单位为克(g)。
平行测定结果用算术平均值表示，保留至小数点后1位。
9 重复性
在同一实验室，由同一操作人员使用同一台仪器完成的两个平行测定的相对偏差不大于7%
 
本标准是在查阅了大量国内外文献的基础上，根据我国的技术发展水平研究制定的。
本标准由国家质量监督检验检疫总局提出。
本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。
本标准起草单位:国家饲料质量监督检验中心(北京)。
本标准主要起草人:林东下、赵根龙、高生、李兰、魏秀莲、范理、苏晓鸥、靳松。
　　1、流动相的抽作要求：
　　
　　液相级色谱醇，二次蒸馏水，缓冲盐一定要过滤；
　　
　　流动相脱气至关重要（可采用抽滤，超声波脱气等方法）
　　
　　2、吸滤头：
　　
　　特殊情况下可拆下滤头抽取以判断其中是否堵塞；亦可用注射器吸取流动相通过吸滤头打出以判断其是否堵塞。若有堵塞情况可用异丙醇超声波清洗；清洗不成功则需要更换。
　　
　　3、单向阀：
　　
　　如遇到泵压不稳或流动相不能抽取，则可能是单向阀出现问题，卸下用异丙醇超声波清洗，清洗时须按其安装的方向放置在小烧杯中，切记不可与安装方向倒置超洗！
　　
　　4、泵头：
　　
　　泵头漏液或出现其它故障一般要申请维修（如漏液，或更换柱塞杆及其密封垫等）
　　
　　5、过滤器：
　　
　　当色谱峰出现异常情况时，有可能是此部件被污染，拆下用异丙醇超洗或更换过滤垫片。
　　
　　6、排液阀：
　　
　　此处不能完全密封或漏液时一般是其中的垫片污染或磨损，可卸下后取出其垫片用异丙醇超声波清洗或更换垫圈。
　　
　　7、手动进样器：
　　
　　平时应注意用二次蒸馏水和甲醇在装载状态及进样分析状态清洗；如出现漏液现象，原因极可能为转子密封垫磨损或污染，一般须申请维修或更换配件。
　　
　　8、流通池：
　　
　　在色谱峰不正常时会可能是此部件补污染。可拆卸后取出其中的垫片用异丙醇超洗（可根据说明书进行操作或申请维修）。
　　
　　9、工作站：
　　
　　出现死机可重起计算机；不正常运行时，首先可更换电脑测试其硬件故障；或在本机上重新插拔接口、重新安装软件。

    日常中经常会遇到液相色谱仪使用过程中冒出气泡，一般是由于温度上升，压力下降造成的。

    温度上升或柱温上升，当接近试剂沸点时，试剂汽化产生气泡，试剂中已含微小气泡，因加热变大而产生气泡。压力下降产生气泡，流动相中一直包含微小气泡，无论超声过滤，均不能池底去掉它，那么当压力下降时，微小气泡将长大，且多个小气泡易聚集成大气泡，而影响正常实验。

    气泡产生原因分析处理：

    1、泵头：泵头是压力变化最剧烈的地方，也是最易产生气泡的地方，泵头靠负压而吸液，而负压必然使流动相中的小气泡长大，当泵腔变正压时，已长大的气泡未必能全部变小流入后续液路，则泵腔内将积存气泡，从而影响吸液精度，鉴于此，泵头上专门设计了排气阀，便于泵头排气，观察柱压稳定了说明泵头排气成功。

    2、吸液白管长气泡。

    a、吸液白管接触空气部位漏气，产生可见气泡，吸液白管是常压和负压交臂变化部位，其漏表现为大气进入白管内，而不易见到管内液体漏出。

    处理方法：更换白管。

    b、滤头堵：滤头堵使得液体流入滤头的速度下降，泵强制吸液而产生真空气泡。

    判断：拔掉滤头不再长气泡则是滤头堵。

    处理：A、30%硝酸水液超洗滤头，20分钟左右。

    B、水超洗滤头，注意换水多超几次。

    c、流动相汽化产生气泡。

    尤其是夏天室温高，沸点低的试剂易汽化，比如：乙酸，乙mi，氨水，石油醚等易于汽化。

    处理：超声，降室温。

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