色谱柱在使用前,建议进行柱的性能测试,并将结果保存起来,作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意:柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同;另外,在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是较好条件),只有这样,测得的结果才有可比性。
1、样品的前处理:
a、建议使用流动相溶解样品。
b、使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。使用0.45?m的过滤膜过滤除去微粒杂质。
2、流动相的配制:
液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的,因此要求流动相具备以下的特点:
a、流动相对样品具有一定的溶解能力,保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。
b、流动相具有一定惰性,与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。
c、流动相的黏度要尽量小,以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果;同时降低柱压降,延长液体泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。
d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器,建议使用对紫外吸收较低的溶剂配制。
e、流动相沸点不要太低,否则容易产生气泡,导致实验无法进行。
f、在流动相配制好后,一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测,还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。
3、流动相流速的选择:
因柱效是柱中流动相线性流速的函数,使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱,要追求较好柱效,建议使用较好流速。对内径为4.6mm的色谱柱,流速一般选择1ml/min,对于内径为4.0mm柱,流速0.8ml/min为佳。
当选用较好流速时,分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时,可适当增加甲醇或乙腈的含量)。
在日常分析工作中,色谱柱的正确使用和维护十分重要,色谱柱使用是否得当,直接影响色谱柱的寿命,稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。
在色谱操作过程中,需要注意下列问题,以维护色谱柱。
1、柱子在装卸、更换时,动作要轻,接头拧紧要适度。必须防止较强的机械振动,以免柱床产生空隙。
2、如果仪器用来做常规分析,样品种类不多,但分析次数比较多,则不妨为每一类常规分析配置一根专用柱,这样有助于延长柱子的寿命。
3、避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况;柱压的突然升高或降低也会对柱内填料产生冲击力,因此在调节流速时应该缓慢进行,手动进样时,进样阀的转动不能过缓。
4、应逐渐改变溶剂的组成,特别是反相色谱中,不应直接从有机溶剂改变为全部是水,反之亦然。
5、使用柱温箱时,应注意在流动相进入色谱柱后才能开启柱温箱升温。
6、一般说来色谱柱不能反冲,只有生产者指明该柱可以反冲时,才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。
7、选择使用适宜的流动相,以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一个预柱,分析柱是键合硅胶时,预柱为硅胶,可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶“饱和”,避免分析柱中的硅胶基质被溶解。
8、避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注人柱内,需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一个保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱。保护柱可以而且应该经常更换。
9、经常用强溶剂冲洗色谱柱,清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时,对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡,每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右。
10、保存色谱柱时应将柱内充满色谱级的乙腈或甲醇,柱接头要拧紧,防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置一个晚上或更长时间。
11、色谱柱使用过程中,如果压力升高,一种可能是烧结滤片被堵塞,这时应更换滤片或将其取出进行清洗;另一种可能是大分子进人柱内,使柱头被污染;如果柱效降低或色谱峰变形,则可能柱头出现塌陷,死体积增大。
12、在完成分离分析工作之后,不应立即停机,需及时对色谱分析系统进行冲洗,一般30分钟以上,以除去色谱柱内的杂质。
在液相色谱分离系统中,色谱填料选择的正确与否会直接影响到专业的液相色谱柱分离物质效果的好坏。由于液相色谱填料具有相当宽的选择范围,所以我们在购买液相色谱柱之前有必要对不同液相色谱填料进行一个简单的认识和了解。
第一、正相色谱硅胶基质填料。
正相色谱柱的固定相是由硅胶和其他具有极性官能团组成的键合相填料。其物质分离特点是极性较弱组合最先被色谱柱冲洗出来。而且正相色谱所使用的流动相其极性要低于固定相,流动相通常使用正乙烷和二氯甲烷等。
第二、反相色谱硅胶基质填料。
反向色谱柱的填料是以硅胶材料为主要物质,并与极性相对较弱的官能团组成的键合相。其物质分离特点是极性较强组合最先被色谱柱冲洗出来,而极性弱的组分则会更强的保留在柱子上。反向色谱的流动相的极性相对较强,常配制有机缓冲液作为流动相。目前较为常用的反相色谱填料有C4(B)、C8(MOS)以及C18(ODS)等。
第三、聚合物填料。
这种聚合物的填料一般是由聚甲基丙酸酯或者聚苯乙烯-二乙烯基苯组成。其特点是这种色谱柱的酸碱度适用范围相对较广,且疏水性很强,但它的柱效相对于硅胶基质的填料要低一些。一般将这种大孔的基质填料用于蛋白质的分离。
第四、其他无机填料。
如石墨化碳对于酸碱度和温度没用严格的限制范围,一般可对一些几何导构体进行分离。此外还有氧化铝以及氧化锆等无机填料的应用。
总而言之,如果我们能够全面系统的了解一下液相色谱柱填料的分类及特点,那么我们在选择购买一流的色谱柱时就可以在一个相对较小的范围内顺利找到自己所需要的产品。这样我们就可以在节省选择购买时间的同时,也能快速买到令自己满意的色谱柱。
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