紫外分光光度法(Ultraviolet Spectrophtometry)，又称紫外吸收光谱法( Ultraviolet Moleculor Absorption Spectrophtometry)，它是研究分子吸收190.0~1100.0nm波长范围内的吸收光谱。紫外吸收光谱主要产生于分子价电子在电子能级间的跃迁，是研究物质电子光谱的分析方法。通过测定分子对紫外光的吸收，可以对大量的无机物和有机物进行定性和定量测定。
苯酚是一种剧毒物质，可以致癌，已经被列入有机污染物的黑名单。但在一些药品、食品添加剂、消毒液等产品中均含有一定量的苯酚。如果其含量超标，就会产生很大的毒害作用。苯酚在紫外光区的最大吸收波长λmax=270nm。对苯酚溶液进行扫描时，在270nm处有较强的吸收峰。
定性分析时，可在相同的条件下，对标准样品和未知样品进行波长扫描，通过比较未知样品和标准样品的光谱图对未知样进行鉴定。在没有标准样品的情况下，可根据标准谱图或有关的电子光谱数据表进行比较。
定量分析是在270nm处测定不同浓度苯酚的标准样品的吸光值，并自动绘制标准曲线。再在相同的条件下测定未知样品的吸光度值，根据标准曲线可得出未知样中苯酚的含量。
仪器与试剂
1．紫外可见分光光度计
2．容量瓶（1000ml、250ml）
3．比色管（50ml）
4．吸量管（5ml、10ml）
5．苯酚（AR）
准确称取苯酚1.000g于200ml蒸馏水中，溶解后定量转移到1000ml的容量瓶中，作为储备液。
紫外可见分光光度法测定苯酚含量实验步骤
1．打开仪器及计算机、显示器、打印机电源，进入软件操作系统，待仪器自检结束，点击OK，进入操作主页面。
2．波长扫描
(1)确定波长扫描参数：
光谱带宽2.0nm
光度测量形式 吸光值
扫描范围 200～500nm
扫描速度 1000nm/min
数据间隔点 1nm
存储文件 选择路径和文件名
(2)做基线
将盛有参比液的比色皿分别放入参比光路和样品光路，开始进行基线扫描
(3)波长扫描
将盛有样品和参比液的比色皿分别放入参比光路和样品光路，点击开始扫描
(4)定性分析
将试样的波长扫描图与已知样的在相同条件下的波长扫描图或已知的谱图相比较，对试样进行定性分析
3．定量分析
(1) 标准系列的配制
于5支50ml的比色管中，用吸量管分别加入0.5 ml、2ml、5ml、10ml、20ml的10ug/ml苯酚标准溶液，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。
(2) 确定定量分析参数
设置a：方法 对每个标准品的重复读取次数 1
对每个样品的重复读取次数 1
是否需要测量标准样品 需要
校正曲线 线性
计算方式 用峰高计算定量的数值
b：样品 总共测量样品的个数 6
输入待测样品的名称 苯酚
样品标签从第几号开始编辑 1
输入标准样品浓度值
在std栏中对标准样品进行标识
c：质量控制 需要质量控制
对有问题的测量结果标记后继续测量
输入允许的最大浓度
输入允许的最低浓度
d：仪器 狭缝 2.0nm
测定形式 吸光值
强度倍数 1
工作波长 270nm
积分时间 5s
把空白液注入两个比色皿内，并分别放入参比和样品光路，按“zero”进行调零，然后按“OK”
e：报告 需要报告 要在线报告
f：结果储存 输入选择的路径与文件名
(3)开始定量测量，按照提示放入各样品
(4)观察标准、样品及校正曲线
紫外可见分光光度计具有灵敏度高、准确度高、选择性好、适用浓度范围广等优点，广泛地应用于化工、冶金、地质、医学、食品、 制药等部门及环境监测系统。
紫外可见分光光度计的原理：
物质的吸收光谱本质上就是物质中的分子和原子吸收了入射光中的某些特定波长的光能量，相应地发生了分子振动能级跃迁和电子能级跃迁的结果。
由于各种物质具有各自不同的分子、原子和不同的分子空间结构，其吸收光能量的情况也就不会相同；
因此，每种物质就有其特有的、固定的吸收光谱曲线，可根据吸收光谱上的某些特征波长处的吸光度的高低判别或测定该物质的含量，这就是分光光度定性和定量分析的基础。
紫外可见分光光度计的使用方法：
（1）接好线路后，先检查各开关是否在“关”处，光路闸门放在黑点处，再将电源插头插入220V交流电源上，打开电源开关和光源开关，将光路闸门放在红点处。
（2）取出比色皿，将其中一只装空白溶液，其余三只装待测溶液，放在定位盒内，盖上暗箱盖，装溶液前比色皿用蒸馏水洗净；
并用溶液荡洗数次后，再盛至体积，池外应赶紧，若有水滴，应用镜头纸吸干，取用时用手捏住比色皿的毛玻璃面。
（3）用波长调节器调到所需的波长，将空白溶液正对光路，调光量调节器，使检流计上光点准线对准透光率为100的位置；
拉动拉杆，使待测溶液进入光路，读取微电计标尺上的透光率，测定完毕，及时关闭光路闸门，检查电计的零点位置，保护硒光电池。
（4）紫外可见分光光度计应安放在清洁、干燥、无腐蚀气体和较暗的室内；
仪器使用完毕后应擦拭干净，各开关关闭，紫外可见分光光度计连续使用时间不应超过4h。
紫外可见分光光度计属于精密光学仪器，出厂前经过精细的装配和调试；
如果能对仪器进行恰当的维修与保养，不仅能保证仪器的可靠性和稳定性，也可以延长仪器的使用寿命。
1、工作环境检查：
1）放置要求：
仪器应平稳的摆放在水平固定的桌面上。
(因为分光光度计为精密光学仪器,在运行的过程中如果桌面不稳；
会影响其工作状态,且仪器处在工作状态时，灯丝处于高温状态,此时如果有剧烈的震动会导致灯丝折断。)
2）温度要求：工作环境的温度在5-35度之间。
(仪器在工作状态时内部较热需要用仪器自身的散热风扇与外界空气进行热交换散热；
如果外界温度过高,会导致仪器内部温度过高,从而加速仪器电器件与灯的老化速度,从而影响仪器的使用寿命。)
3）湿度要求：
工作环境的相对湿度不超过85%。
（仪器内部有很多电器元件与光学件，在湿度太高的情况下，电器件容易老化或烧坏， 光学件表面的镀铝膜也容易发霉。）
4）空气状况：
空气中不应有足以引起腐蚀的有害气体和过多的尘土存在。
2、样品室检查：
1）在开机之前，先要检查样品室中是否有比色皿或其他物品；
因为仪器在开机后要进行一系列的功能自检，如果有物品放在样品室中会导致自检出错。
2）每次使用后应检查样品室是否积存有溢出溶液，须经常擦拭样品室，以防止废液对部件或光路系统的腐蚀。
3）在测试完成后，请及时将样品从样品室中取出，否则，液体挥发会导致镜片发霉。
对易挥发和腐蚀性的液体，尤其要注意！
如果样品室中有漏液，请及时擦拭干净，否则会引起样品室内的部件腐蚀和螺钉生锈。
3、仪器的表面清洁：
仪器外壳表面经过喷漆工艺处理过，如果不小心将溶液漏洒在外壳上，请立即用湿毛巾擦拭干净，杜绝使用有机溶液擦拭。如果长时间不用时，请注意及时清理仪器表面的灰尘。
4、比色皿清洗：
在每次测量结束或溶液更换时，您需要对比色皿进行及时清洗；
然后放在低浓度酸性溶液里浸泡，浸泡后用蒸馏水冲洗比色皿的内外壁，否则比色皿壁上的残留溶液会引起测量误差。
5、电源检查：
1）插电源插座时，请检查当前电压是否与仪器标识的电压一致。
2）因为各个地区电网的质量差异很大，所以为了使仪器运行得更稳定和更可靠，建议给仪器外配一个稳压器。
3）仪器不用时请关机，并拔掉电源插头，以防止实验室的电源地线不好，而导致在雷雨天气时损坏仪器。
6、提示：
为缩短自检时间，仪器在开机时所进行的自检只是对一些常规的项目进行检查。
而仪器在运输、搬运与使用一段时间后（一般一个月）会导致结构件累计误差的产生；
所以我们建议用户在出现上述情况或感觉仪器测试数据与经验值相差较大时，应对仪器进行一次波长校正和暗电流校正。（具体操作方法见本手册中的“系统应用”一节）
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