色谱柱破裂
熔融石英毛细管柱的聚酰亚胺涂层如有少许破裂它就会断裂,聚酰亚胺涂层保护着脆弱的熔融石英毛细管,柱箱连续地加热和冷却,柱箱风扇的震动,把色谱柱绕在圆形柱架上都会对毛细管造成应力,最后在很小的弱点处会破裂,聚酰亚胺涂层形成的划痕或磨损处会造成弱点,当利刃或薄片触及毛细管时常会造成划痕,色谱柱挂钩和标签、柱箱中的金属边缘、色谱柱切割器和实验室实验台上各种类似的东西都是利刃或薄片的来源。
色谱柱自身破裂的情况很少,色谱柱制造业注意剔除任何有弱点的柱子,以免使色谱柱的完美性受到影响,大内径柱更容易破裂。
热损坏
超过色谱柱的温度上限会造成色谱柱固定相和管表面的加速损坏,这样会造成色谱柱的过量流失,活性组分形成拖尾,柱效降低。因此,在色谱柱明显的损坏以前于温度极限以上运行需较长时间,当有氧存在时会大大加速热损坏,在有泄漏或过加热加温色谱柱会加速损坏并永久性损坏色谱柱。
设定GC的最高柱温在色谱柱高温极限或稍高于这一极限是可以避免热损坏的方法,这样可避免色谱柱意外的过热,如果色谱柱受到热损失,它仍然还会有一定的功能。把色谱柱从检测器上卸下来,在极限的恒温温度下加热8-16小时,把色谱柱接到检测器的一端截去10-375px,按正常情况安装色谱柱并进行老化。但是这一色谱柱不能恢复到原来的性能,可是常常仍具有一定的功能,在热损坏之后色谱柱的寿命会缩短。
氧损坏
在近于室温下不会对色谱柱有损害,柱温升高时会严重损坏色谱柱。通常对于极性固定相,发生严重损坏时的温度和氧浓度都很低。长时间暴露在氧气中是有问题的。短时间地暴露在氧气中如注射空气或拿掉隔垫螺帽时不会有什么问题。
在载气通道上有泄漏的地方(如气路、接头、进样器)往往是进入氧气的源头。当色谱柱加热时,就会很快损坏固定相,这就会过早地引起色谱柱的过度流失、活性化合物有拖尾、降低柱效。在不太严重的情况下色谱柱还会有一定的分离功能,但是性能已经下降了。在严重的情况下这支色谱柱就完全不能使用了。
让系统避免和氧接触和避免泄漏是不受到氧损坏较为有效的方法,对GC系统的良好维护包括定期对管线和压力调节器进行检漏、定期更换隔垫,使用高纯度载气、安装氧捕集以及不要等载气钢瓶用空了再进行更换。
化学损坏
有相当少数化合物会使固定相遭到破坏,不挥发性化合物(高分子量或高沸点)进入色谱柱常常会降低色谱柱的性能,但是不会破坏固定相。这些沉积的残留物可以用溶剂冲洗色谱柱而除去以恢复色谱柱的性能。
要避免进入色谱柱的主要化合物是无机或矿物碱和酸,这类酸包括盐酸、硫酸、硝酸和磷酸。碱包括氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化铵。这些酸和碱不挥发,积累在色谱柱前端。如果使其停留在那里就会破坏固定相,使色谱柱过早地大量流失、使活性化合物拖尾、柱效降低。其征兆和热损失及氧损坏类似。
由于化学损失夺发生在色谱柱的前端,所以处理或把色谱柱前端切掉0,5—1m可消除任何色谱方面的故障,在比较严重的情况下,可以截去5m或更长的一段。如果使用保护柱就会减小色谱柱被损坏的长度,但是需要处理保护柱,酸或碱常常会破坏熔融石英管的去活表面,因而会引起活性化合物的峰型变坏。
色谱柱被污染
有两种基本类型的污染物:不挥发性污染和半挥发性污染物,不挥发性污染物或残留物不能从色谱柱里洗脱出来,而是累积在色谱柱里,这样它就成为涂渍了残留物的色谱柱,因而影响溶质的分配,即溶质溶入和蒸发出固定相的正常分配,而且残留物还会和活性化合物相互作用,引起峰的吸附问题(甚至造成拖尾或减少峰面积)。活性溶质是指那些含有羟基或氨基和一些硫醇基及醛的物质,半挥发性污染物或积累在色谱柱中的残留物,最终会洗脱出去。但需要几个小时或几天才完全洗脱出来,和不挥发性残留物一样,它们也会引起峰形变坏和峰面积减小的问题,此外,常常引起很多基线的问题(不稳定、漂移、噪音、鬼峰等)。
污染物的来源
污染物的来源有许多,其中进样是主要的来源。萃取自最差基体的样品,生物液体和组织、土壤、废水等类似的含有大量半挥发和不挥发物质的基体,甚至使用仔细及彻底的萃取方法,样品也会含有少许这些物质并带到注射样品中。几次到几百次进样会造成残留物的积累故障,进样技术如柱上进样、不分流进样和大口径柱直接进大量样品到色谱柱中,这些进样方法常常会造成色谱柱的污染。
保养措施
最大限度地减少半挥发性和不挥发性样品残留物是减少污染问题的可以方法,然而污染物的存在常常是不知道的。严格和彻底的净化样品是防止污染问题的可以办法,使用保护柱可以减轻或推迟色谱柱受到污染的损害。如果色谱柱被污染了,可以的办法是用溶剂进行清洗除去污染物。建议不要使用长时间加热的方法来处理受到污染的色谱柱。
高效液相色谱仪是进行定量分析,杂质检查等分析工作中主要的精密仪器,色谱柱是液相色谱仪的zui核心部件。
在这里,介绍一下色谱柱使用中的注意事项及使用心得。
1、柱头类型和不锈钢毛细管接头的匹配
色谱柱是消耗品,不是仪器原配的情况很多,如果接头和柱头深度匹配将会产生漏液或者死体积过大的现象。
接头比柱头深度长,不易拧紧而漏液;接头比柱头深度短,柱头内留有空隙而产生死体积,使谱带展宽和峰拖尾。
2、溶剂的匹配转换
色谱柱内保存溶剂和仪器系统内存留溶剂,如果和流动相不匹配,使用前需进行转换。
特别是流动村j含缓冲盐时,如保存溶剂足纯有机相或有机相比例高,直接将新柱接人使用,会导致缓冲盐在柱内结晶析出,造成柱头堵塞。建议仪器和色谱柱经常使用,用10%的有机溶剂保持即可。
3、流动相及待测样品的过滤
日常分析工作中,我们使用的流动栩和待测样品应用0.45pm滤膜过滤后再连接或注入到色谱仪上。
对于有机相比例高的流动栩可以一起过滤出来备用,但是有机相比例小的流动相一定要现用现滤,分析结束时一定要先用10%的有机溶剂冲洗管路及色谱柱,为有机相少的流动相容易滋生细菌,造成色谱柱堵寒,影响色谱柱性能。
4、色谱柱分析时应进行平衡和老化
进行的方法是运行几次完整的分析程序(包括进样),直到观察到峰形、保留时间和峰面积稳定为止。对某些特定的待测物,如分子量大于1000的,闪扩散速度慢,老化时间相应要长,可采取大浓度进样或在同一个洗脱周期内连续进样多针的方式加快老化。
5、pH使用范围
一般认为硅胶基质柱子的pH使用范足2-8,如果选用的是高品质硅胶,加上高密度键合和双封尾,使pH耐受范同zui大提高到lO。
注射用头孢拉定流动村1pH值为8,对色谱柱伤害很大,需要选择pH值耐受性高的色谱柱。
6、峰形异常
峰形对称性的优劣对峰面积和分离度有很大的影响,从而影响分析结果的准确性。先检查样品足否过载,由于样品过载引起的峰形后拖不能通过改变色谱条件消除。
如果发现过载,需降低进样量(包括进样体积或浓度),进样量越小,峰形越好,例子如头孢尼西钠的测定。其次,硅醇基次级保留引起部分峰拖尾。
这种情况发生,选择高密键合和彻底的双蜂尾工艺的色谱柱能改善峰形。另外,溶解样品的溶剂洗脱能力比流动相强会发生峰前延,所以样品zui好选用流动相溶解。
7、色谱柱保存
短期保存(隔夜或隔周末)用所用的流动相(不含缓冲盐)保存为佳,以尽量减少下次使用的平衡时间。
一般只建议在长期保存反相柱的时候用纯醇或乙腈,使用80%左右有机相保存也属好的选择,且足以避免长菌。
强烈建议在柱身上贴标签标明保存溶剂。离子交换柱和水性凝胶柱等适合保存在水溶液中的色谱柱,可加0.05%化钠溶液防止K菌。正相柱无论是短期还足长期,都推荐保存住所用流动相巾。
色谱柱是色谱仪器中重要组成部分之一,它是分离不可缺少的一部分。因此不同的样品分类,用到不同的色谱柱。
色谱柱可简单分为以下几类:
a、根据分离方式分为:
(1)正相色谱柱:SIL--磷脂、NH--糖、维生素E,CN--甾类激素。
(2)反相色谱柱:ODS(C18)、(C8CNTMSPheny1)低分子量化合物。
(3)离子交换色谱柱等。
b、根据所有的担体材料分为三种:
(1)硅胶型:机械强度高,易制成小颗粒,理论塔板数高。
(2)聚合物型:在广泛的PH值范围内稳定。
(3)羟基磷灰石型:对蛋白质等生物高分子样品有特殊的选择性。