液相色谱仪是属于易学难用的仪器，特别讲究“正确使用”和经验。液相工作者接触较多的是流动相，流动相也是造成液相色谱各种问题的主要源头。液相色谱常见的故障一是堵，二是漏。下面就这两分别展开讨论(流动相以甲醇为例，色谱柱以C18为例) 。
为何会堵?
“堵”的表现现象就是柱压异常升高，直接原因就是流路不畅。堵塞的主要位置就是在色谱柱的前端，主要原因就是流动相里有杂质，杂质的主要来源就是细菌。
堵”的原因之一：纯水中的细菌污染
首先我们要认识到，一般的国产甲醇其实不需要额外过滤处理，直接使用没有问题。即使是有些固态微粒杂质，也能在液相流路系统最前端的过滤头上排除，真正容易引起问题的，是水中的细菌。新制备的纯水在室内放置几天就会长菌，而这些细菌虽然肉眼不可见，却足以堵塞柱填料颗粒的空隙，造成柱子很快报废。这就是在配制流动相时造成的细菌污染的原因，解决它的方法很简单，就是确保水的可靠性。
“堵”的原因之二：使用流动相时的细菌污染
指的是：流动相刚开始不长菌，在使用时却产生了细菌污染。这主要是在使用多元液相色谱仪时的一种不良使用习惯造成的。举简单的例子：50%的甲醇水流动相，有两种使用方式。一种方式是在上机前就配好混合在一起，另一种方式是在流路A放纯甲醇，流路B放纯水。从单纯实验效果来说，后一种有明显的优点：首先是简单，不需要实验者另个计算配比混合，其次就是比例准确，能得到保留时间重复性极好实验效果。
但是，它有一个致命的缺陷，就是纯水在流动相瓶中几天时间就会长细菌(很多情况下不仅仅用纯水作流动相，而是用缓冲盐溶液，本身就是优质肥料，细菌长得更迅速)，一旦有细菌柱子就坏得很快。所以这种方式要求操作人员每次实验都要用新制备的纯水，更要求在每次实验后把水相换掉，换成甲醇冲洗干净，这一点在实际工作中很多人意识不强，就是意识到了但多次使用中总有一两次会遗漏，但是往往这一两次就足以产生致命的影响。因为液相色谱柱的堵塞是不可逆的。
所以，宁可牺牲小小的保留时间的重复性，也不要用纯水溶液作为流动相的一组。从实际实验效果来说，我建议用10%的甲醇水代替水溶液(以前我做过不同比例甲醇水的细菌总数实验，在5%就基本可以抑菌，在10%及以上就可以完全杀菌了)，这样可以有效排除长细菌的隐患，既可作流动相，也可冲柱。就算是在配制流动相时会计算得麻烦一些，但是一次麻烦，终身受益。
查堵的方法:
在发生“堵”的现象后，就需要找出原因，主要是什么位置发生了“堵”。
注意，绝大多数情况下，整个系统只会有一个地方发生堵塞。查堵的方法是从尾向前逆向分段拆开，仔细观察压力数值，如果某一个部件(柱子除外)装上和拆下时的压力差别很大，可发展变化判断。至于柱的堵塞，可以通过换同样规格的柱的压力是否一致来判断。
溶剂入口过滤头
未经过滤的溶剂或溶剂瓶中生长的微生物都会降低溶剂入口过滤头的寿命,并影响泵性能.一般3个月清洗或更换。将溶剂入口管从过滤头和瓶盖组件处拨下,如果管线中充满溶剂,当过滤头性能良好时,溶剂会自由地从管中滴出.如果堵塞，就没有溶剂或只有很少量的溶剂从管中滴出。不要使用超声清洗溶剂入口过滤头，否则玻璃颗粒可能是破碎造成堵塞。
“漏” 分两种：漏液和漏气。
漏液：
液相色谱仪从流动相瓶到废液瓶之间的流路是一个全封闭体系，内部压力很高，但外部却能保证一滴不漏。如果某个部件发生漏液，那就是故障所在。
漏液的原因分两种：
接触硬件不当：在更换零件如流路管或换柱时，换的接头接口不匹配，造成漏液。要注意不同公司的柱子接头很多是不同的，甚至同一家公司在不同时期生产的液相柱接头也有很大区别。当然选项用PEEK接头是一较好是一个较好的解决方法，不仅通用性好，而且靠手拧就能保证不漏液。即使是接口本身是匹配的，但是如果操作不当也会漏液，一种不当就是力度把握不好，拧得太紧或太松;另一种不当就是致命的错误：滑丝，这往往是动手能力不太强，螺丝钉很少拧的工作者犯的错误，滑丝的后果不仅是漏液那么简单，常造成重要部件的报废。解决这个问题只能靠恶补基本功来实验，那就是拧螺丝。
使用仪器不当：只要互相有10%比例就不会出现这个问题。另一原因是在用缓冲液盐溶液(不论甲醇含量有多少)作流动相时，实验结束后没有换甲醇水冲洗，使得微渗的流动相干燥形成晶体造成。不过，输送泵漏液并不是非得马上修不可，冲洗干净并在以后的使用中多加小心一般都可以正常使用。检测器漏液是个很麻烦的事，一般都是吸收池的问题，更换的费用相当高。但是并不是说一定要马上更换，还可以从实际实验效果看能否凑合使用。
漏气：
漏液是从内部向外漏，而漏气则是外部了的气体进入液相色谱仪的流路内部形成气泡。下面按流路的方向逐个部件分析产生气泡的原因和相应解决方法。
如果流路管中真漏气了怎么办?
我的建议是用外力使管路中充满液体。
1、找到流路管进入输送泵的接头。
2、拧下来。
3、用一干净洗耳球的尖端对准管路的平整切口。
4、吸液体，看液面从流动相瓶里上升，至离洗耳球5cm左右时停止该动作。
5、快速把接头拧回输送泵上(这个过程可能会有少许流动相外泄，这是正常现象)。
6、开机，打开排液阀门，启动输送泵。
7、等排液管中流出的溶液没有气泡时，再关闭排液阀，仪器正常工作。
漏液及处理方法：
液相色谱仪的应用，可用于高沸点、热稳定性差以及具有生理活性物质的分析。一般来说，沸点在450℃以下，相对分子质量小于450的有机物可用液相色谱仪分析，但这些物质只占有机物的15%～20%，其余的80%～85%有机物原则上都可采用高效液相色谱仪分析。
色谱柱的使用和维护，色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。
在色谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱。调节流速太快，避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓。
反冲色谱柱，一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效，预柱和保护柱，选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。
有时可以在进样器前面连接一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶“饱和”，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。
避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱。保护柱可以而且应该经常更换。
液相色谱仪的基本结构，由输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和数据处理系统等组成。
工作原理，利用混合物各组分在固定相和流动相中溶解、分配或吸附等化学作用性能的差异，使各组分在作相对运动的两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离。
从液相色谱仪工作流程中看到，色谱柱是实现分离的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构、填料特性、填充质量和使用条件有关。
色谱填料：经过制备处理后，用于填充色谱柱的物质颗粒，通常是5-10粒径的球形颗粒。
色谱柱管：内部抛光的不锈钢管。典型的液相色谱分析柱尺寸是内径4.6mm，长250mm。
色谱柱：也称固定相，是将色谱填料填充到色谱柱管中所构成的，色谱柱的填充，干法填充：在硬台面上铺上软垫，将空柱管上端打开垂直放在软垫上，用漏斗每次灌入50-100mg填料，然后垂直台面墩10-20次。
湿法填充：又称淤浆填充法，使用专门的填充装置。
液相色谱仪是一种常见的色谱分析方法，与气相色谱相比液相色谱可以在常温中操作，且不受样品挥发度和热稳定性的限制。这使得液相色谱非常适合相对分子量较大，难汽化，不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物和高聚物的分离分析。
然而要选购一台品质优良的液相色谱并不容易。液相色谱仪的指标很多，有关于泵的、关于检测器的、关于色谱柱的……不过，从选购角度考虑，可以优先考虑噪音、漂移、最小检测浓度、定性定量重复性等主要技术指标。当然，这些指标都要放在系统、回路里去看去比较。
1.噪音
噪音指由仪器的电器元件、温度波动、电压的线性脉冲以及其他非溶质作用产生的高频噪声和基线的无规则波动产生的声音。噪音的大小直接关系到仪器的检测灵敏度，噪音越大检测的灵敏度就越低。对于检测低含量的样品就要求仪器的噪音越小越好，否则噪音过大将会导致基线不稳，甚至影响分析结果；
2.最小检测浓度(最小检测限)
最小检测浓度是反映仪器灵敏度的重要参数。根据公式CL=2×Nd×C/H(CL：最小检测浓度 Nd：噪音 C：样品浓度最小检测浓度 H：样品峰高)，最小检测浓度是和噪音成正比的，噪音越大，最小检测浓度就越大，灵敏度就越低。如果选购的仪器回避了这个指标，说明他们不愿在最小检测浓度的基础上去比较噪音；
3.漂移
漂移是指仪器稳定后一段时间内基线漂离原点的距离，通常用来衡量仪器稳定快慢。高品质的仪器能在较短的时间内达到稳定，从而在一定程度上提高分析效率；
4.定性定量重复性
主要是考核仪器稳定性的指标，这对于分析样品来说是非常重要的。好的仪器其稳定性应该是十分不错的，这就要求多次进样保留时间及含量的一致性，这样做出来的结果才能使人信服。虽然这些指标都属于检测器，但是就像前面所说的，条件是要放在整个回路和系统里去看去比较。
例如：泵的脉动会直接影响噪音指标、泵的流量准确度指标，以及密封性不好也会影响相关指标。所以要系统地看指标才可以反应出仪器的一些真实水平。
在选择仪器的时候需要充分考虑到仪器的方方面面才能拿到自己满意的机器。
首先从常规的几个部件做个简单的分析。
（一）输液泵应具备如下性能：
① RSD（流量稳定性）<0.3%;
② 流量范围宽， 0.1～5.0ml/min内连续可调，有的实验则需要更大流量;
③ 输出压一般应能达到150~400 kg/cm2,流量越大,最高压力越低;
④ 液缸容积小,有助于减少流动相死体积，利于清洗。
⑤ 密封性能好，耐腐蚀。
（二）检测器
①紫外检测器，分为可变单波长检测器VWD和二极管阵列检测器DAD，可以检测有紫外吸收的物质
②荧光检测器，检测有荧光的物质
③视差折光检测器，通用型检测器，但对环境要求极为苛刻，而且灵敏度低
④ELSD，蒸发光散射检测器
⑤MSD，质谱检测器
常用的是紫外检测，然后是MSD和ELSD
（三）色谱柱
要求柱效高、选择性好，分析速度快等。目前市场上销售的用于HPLC的各种微粒填料如多孔硅胶以及以硅胶为基质的键合相、有机聚合物微球(包括离子交换树脂)、氧化铝、多孔碳等，其粒度一般为3,5,7,10μm等，柱效理论值可达5~16万/米。
一般的分析只需5000塔板数的柱效;同系物分析500即可;难分离物则可用2万的柱子。
因此一般10~30cm左右的柱长基本能满足复杂混合物分析的需要。所以要根据自己实际情况来选择合适的柱子。
柱效受柱内外因素影响，为使色谱柱达到较佳效率，除柱外死体积要小外，还要有合理的柱结构(尽可能减少填充床以外的死体积)及装填技术。即使可以的装填技术，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情况总是不一样的，靠近管壁的部位比较疏松，易产生沟流，流速较快，影响冲洗剂的流形，使谱带加宽，这就是管壁效应。这种管壁区大约是从管壁向内算起30倍粒径的厚度。在一般的液相色谱系统中，柱外效应对柱效的影响远远大于管壁效应。
此外，温度在色谱分析中是个不容忽视的环境条件，环境温度对溶剂的溶解能力、色谱柱的性能、流动相的粘度都有影响。而且不同的检测器对温度的敏感度不一样。保持恒定的温度对实验而言是个绝对不容忽视的条件，因此也要留意注温箱的选择。以保证实验结果的准确性。
（四）进样器
进样装置要求：密封性好，重复性好，死体积小，保证中心进样，进样时对色谱系统的压力、流量影响小。而且进样方式多种多样，可分为隔膜进样、停流进样、阀进样、自动进样。自动进样器则是市场发展的趋势。
（五）数据处理系统
一般专业的液相色谱仪生产厂家都有自己配套的液相色谱仪控制软件。但有不少液相色谱仪可以使用通用型的色谱数据工作站进行数据计算处理。进口软件价格比较高，这个自己得根据资金选择了。
二元泵和四元泵的区别二元有两个泵，泵后混合，气体的溶解度随压力的增大而增大，所以二元高压混合不会产生气泡。四元只一个泵（另外一个是辅泵），是泵前混合，在常压下进行的，两种液体混合时，会降低气体在混合溶液中的溶解度，通常会有气泡产生，所以四元低压梯度系统一定要配在线真空脱气机
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