色谱柱的使用寿命,除了与所分析的样品和流动相及使用频率有关系外,主要的是与日常的维护密切相关。色谱柱的使用寿命主要是柱效和柱压两个指标来衡量,如果一支色谱柱柱效太低或柱压太高,通常被认为该色谱柱已经结束。因此,延长色谱柱使用寿命的关键是,消除引起柱效下降和柱压升高的因素。以下是色谱柱的维护方法:
一、流动相的PH应在使用的范围内
流动相超过其PH范围将会导致硅胶基质流失和键合相碳链断裂,使柱效下降,使用寿命变短。由于流动相的PH控制不当而对色谱柱造成的损害,通常很难是色谱柱恢复,因此必须认真对待,严格控制流动相的PH值。
二、去除样品和流动相中的固体颗粒
样品和流动相中含有的固体颗粒物质会堵塞色谱柱筛板,筛板被堵住不仅会引起柱压的升高,而且也会引起柱效下降,因为筛板的堵塞会引起液流不均,导致色谱峰型拖尾、变宽,从而使柱效下降。因此,建议使用超纯水和色谱纯试剂,在分析样品前对样品进行针筒过滤,流动相过0、45μm滤膜。
三、使用保护柱或在线过滤器
样品和流动相经过滤后并不能完全消除固体颗粒物质,因为泵的磨损、密封圈和管路的老化也会产生固体颗粒物质,这些固体颗粒被流动相带入色谱柱,堵塞筛板,导致柱压升高、柱效下降。保护柱和在线过滤器上都有筛板,其孔径与色谱柱孔径相同,因此可以阻止固体颗粒物质到达色谱柱,有效防止色谱柱筛板的堵塞。由于柱压升高在分析故障中占很大比例,因此,除对样品和流动相进行过滤外,建议您在色谱柱进样端加上保护柱或在线过滤器。
如果色谱柱柱压升高是由于进样端筛板被堵引起的,可选择以下方式进行补救:
1、先在色谱柱前加上保护柱或在线过滤器,然后用甲醇、水=20/80ml/min反向冲色谱柱180min、
2、先在色谱柱进样端加上保护柱或在线过滤器,然后反向使用。
四、正确使用缓冲盐
缓冲盐通常易溶于水,难溶于有机溶剂,因此缓冲盐使用不当会使其析出,堵塞填料基质上的微孔和颗粒间的空隙,使填料板结,柱压上升;同时阻碍了基质上键合的碳链自由舒展,使色谱柱的保留能力下降,柱效降低。缓冲盐析出后,去除非常困难,因此,正确的使用缓冲盐对延长色谱柱使用寿命非常重要。
正确使用缓冲盐的目的是防止缓冲盐析出,因此正确使用缓冲盐的方法可归结为一句话:使用前要过滤,使用后要冲洗。具体方法如下:
1、等度条件:使用缓冲盐前和使用后需用过渡流动相以1、0ml/min流速冲洗60min;使用后去除缓冲盐的另一个方法是用过渡流动相以0、2ml/min流速冲洗色谱柱过夜。
2、梯度条件:用含有缓冲盐的流动相跑梯度之前,用与初始流动相组成相同的过渡流动相以1、0ml/min流速冲洗60min,再用该过渡流动相以1、0ml/min冲洗色谱柱120min。含缓冲盐流动相的梯度设定应尽量平缓,以避免梯度过程中缓冲盐析出。
注意:过渡流动相是指有机相和水相的组成与分析流动相相同,区别只是过渡流动相不含缓冲盐。
3、缓冲盐析出的补救方法:
方案1:用甲醇/20/80以1、0ml/min流速35摄氏度条件下反向冲洗色谱柱120min
方案2:用甲醇/水=20/80以0、2ml/min流速反向冲洗色谱柱过夜。
五、防止强保留物质在色谱柱上存留
强保留物质和大分子化合物在色谱柱中累积,对样品中的化合物产生额外的保留行为,不仅引起峰型变宽、拖尾,使柱效下降,同时也会引起保留时间的变化,累积到一定程度时还会导致柱压升高。由于强保留物质和大分子化合物对色谱分离的影响是一个累积效应,需要一定的时间才会体现出来,但对许多药品特别是复杂样品而言,很难判断其是否是含有强保留物质,因此要防止强保留物质的累积,需要在每天的日常维护中用纯甲醇或乙氰清洗色谱柱。
装填好的色谱柱连接在高效气相色谱仪上后,先试压和试漏,然后在恒温下用载气吹洗数小时,再进行分析,此过程称为色谱柱老化。
一、色谱柱老化的目的:
1、任何制作好的新柱,在色谱柱涂渍过程中难免柱内残留有机溶剂,任何固定液都有低沸点的不纯物,不经老化就用于分析,上述低沸点物质大量从柱中流出,会造成基线不稳,有时还会污染检测器。
2、促使固定液均匀牢固地分布在载体和色谱柱内壁,提高柱分离效能,消除不良影响。
3、促使色谱柱内固定相排布更加紧凑和均匀,提高柱性能并使其稳定。
装填好的色谱柱经过老化后,柱效和性能稳定了,才可使用。
二、色谱柱老化注意事项:
1、新制作好的色谱柱老化时一定不能接检测器,否则容易污染检测器。
2、老化温度应高于分析使用温度25℃以上,但不能超过固定液允许的最高使用温度。
毛细管色谱柱由柱管、压帽、卡套(密封环)、筛板(滤片)、接头、螺丝等组成,其两端的柱接头内装有筛板。
毛细管色谱柱正确安装的步骤如下:
步骤一:检查气体过滤器、载气、进样垫和衬管等检查进样垫和气体过滤器,保证辅助气和检测器用气通畅有效。如果以前做过沸点较高的化合物,需要将进样口衬管清洗或更换。
步骤二:将螺母和卡套装在柱上,并将色谱柱两端口小心切平在色谱柱的一端装上相应的螺母和卡套,此时色谱柱端口无前后之分,色谱柱支架的支撑部分应总是朝向着柱箱门。安装好螺母和卡套后,将色谱柱端口切平,并用放大镜进行检查,以确认切口和管壁成直角,并且没有残留的碎屑,没有毛边或不平的切割面。
步骤三:将色谱柱连于进样口上通常来说,色谱柱的顶端应保持在进样口衬管的中下部,当进样针穿过隔垫完全插入进样口后,如果针尖与衬管中的色谱柱顶端相差1-2cm,这就是较为理想的状态。从色谱柱架上取出需要连接的足够的长度,并按步骤2切割柱子,连接到进样口。避免用力弯曲压挤毛细柱,并小心不要让标记牌等有锋利边缘的物品与色谱柱接触磨擦,以防柱身断裂或受损。将色谱柱正确地嵌入进样口后,用手把连接螺母拧上,用手拧紧后用扳手再拧1/4-1/2圈。
步骤四:接通载气载气必须为高纯氮气(或氦气),纯度达99.999%,使用极性柱时,载气加脱氧管进一步脱氧,这样可延长柱子的使用寿命。当色谱柱与进样口连接好后,接通载气。调节柱前压力以得到合适的载气流速。将色谱柱的另一端(空端),插入装有己烷的样品瓶中,正常情况下,我们可以看见瓶中稳定持续的气泡。如果没有气泡,就要重新检查一下载气装置和流量控制器等是否安装完全或设置正确,并检测一下整个气路有无泄漏。等所有问题解决后,将色谱柱端口从瓶中取出,擦试干净,保证柱端口无溶剂残留,再进行下一步安装。毛细管柱前压参考设置(Mpa)柱长m柱内径(mm)0.250.320.53150.050.040.02300.10.080.03500.180.140.05
步骤五:将色谱柱连于检测器上其安装和所需注意的事项与以上色谱柱与进样口联接(步骤3)部分所讲述的大致相同。安装时要注意色谱柱末端要高于尾吹点,或按照色谱仪说明书安装。步骤6:进行气体检漏在色谱柱加热前,要对GC系统进行检漏。建议使用1∶1的异丙醇/水的混合溶液进行检查。步骤7:色谱柱的老化色谱柱安装和系统检漏工作完成后,就可以对色谱柱进行老化了。将色谱柱程序升温至使用温度的30℃以下,恒温30分钟。这样柱子内吸附的组份会被吹出,以免影响您的分析。最后,将色谱柱的温度降低至所需要的温度,即可进行实际样品的分析。
步骤六:进行气体检漏在色谱柱加热前,要对GC系统进行检漏。建议使用1∶1的异丙醇/水的混合溶液进行检查。
步骤七:色谱柱的老化色谱柱安装和系统检漏工作完成后,就可以对色谱柱进行老化了。将色谱柱程序升温至最高使用温度的30℃以下,恒温30分钟。这样柱子内吸附的组份会被吹出,以免影响您的分析。最后,将色谱柱的温度降低至所需要的温度,即可进行实际样品的分析。
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