色谱柱的利用寿命,除了与所分析的样品和流动相及利用频率有关系外,主要的是与日常的委会密切相关。为延长色谱柱的利用寿命,维护您的利益,请仔细阅读此部分。 色谱柱的利用寿命主要是分局柱效和柱压两个指标来衡量,假设一支色谱柱柱效太低或柱压太高,通常被认为该色谱柱已经结束。因此,延长色谱柱利用寿命的关键是,消除引起柱效下降和柱压升高的因素。
以下是色谱柱的日常维护点子:
1.流动相的PH应在利用的范围内反相色谱柱由于填料中存在Si-C和Si-O键,流动相超过其PH范围将会导致硅胶基质流失和键合相碳链断裂,使柱效下降,利用寿命变短。由于流动相的PH 控制欠妥而对色谱柱造成的损害,通常很难是色谱柱恢复,因此必须认真对待,严格控制流动相的PH值。
2.去除样品和流动相中的固体颗粒 样品和流动相中含有的固体颗粒物质会堵塞色谱柱筛板,筛板被堵住不仅会引起柱压的升高,而且也会引起柱效下降,因为筛板的堵塞会引起液流不均,导致色谱峰型拖尾、变宽,从而使柱效下降。因此,建议利用超纯水和色谱纯试剂,在分析样品前对样品进行针筒过滤,流动相过0.45μm滤膜。
3.利用维护柱或在线过滤器 样品和流动相经过滤后并不能完全消除固体颗粒物质,因为泵的磨损、密封圈和管路的老化也会产生固体颗粒物质,这些固体颗粒被流动相带入色谱柱,堵塞筛板,导致柱压升高、柱效下降。维护柱和在线过滤器上都有筛板,其孔径与色谱柱孔径相同,因此能够阻止固体颗粒物质到达色谱柱,有效防止色谱柱筛板的堵塞。由于柱压升高在分析故障中占很大比例,因此,除对样品和流动相进行过滤外,建议您在色谱柱进样端加上维护柱或在线过滤器。 假设确认色谱柱柱压升高是由于进样端筛板被堵引起的,可选择以下方式进行补救:
先在色谱柱前加上维护柱或在线过滤器,然后用甲醇、水=20/80ml/min反向冲色谱柱180min。
先在色谱柱进样端加上维护柱或在线过滤器,然后反向利用。
色谱柱参数
物理性质
柱长,内径,如250*4.6mm。一般柱长在2—250mm,柱越长,分离度越高,但柱压更高,分离所需时间更长;但分离度与理论塔板数的平方根成正比,所以一昧增加柱长并不是较为有效的分离手段,一般情况下,150mm、5um的填料可以提供足够的塔板数。
粒径,影响色谱分离度。粒径越小,分离越快,柱效越高,但柱压力越高,柱容易被污染,导致柱寿命降低。常见分析柱通常使用5um填料,复杂的多组分样品分离一般使用3.5um粒径,更大内径的制备色谱柱通常使用更大的粒径。如果固定相选择是正确,但是分离度不够,那么选用更小的粒度的填料是很有用的。3.5um填料填充柱的柱效比相同条件下的5um填料的柱效提高近30%;然而,3.5um的色谱柱的背压却是5um的2倍,因此如何选择填料粒径需要根据现实情况而定。
孔径,60A,120A,300A等。孔径小,则含孔率高,比表面积大,载碳量高;色谱柱填料孔径大小需和分子大小相匹配,保证分子自由进出填料孔并与孔内表面的键合相进行分离分配,通常要求孔径直径是分子直径的3倍以上,一般小分子使用80—120A,大分子使用300A。
颗粒形状,一般有球形和不规则形,当使用黏度较大的流动相时,球形颗粒可以降低柱压,延长色谱柱寿命。
苯乙烯—二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂,化学稳定,应用pH范围宽,具有更强的疏水性,对蛋白质等样品分离效果较好;但强度较小,有机溶剂可能导致聚合物溶胀而受损,批次重复性较差,商品化色谱柱不多,一般价格较贵。
载碳量:基质表面键合相的比例,载碳量高,则保留增加,适合分析非极性化合物。
键合相:键合试剂不同,对化合物的选择性不同,一般长链的烷基键合相(C18 C8)比短链的(C4 C3)稳定;非极性的键合相比极性的键合相(-NH2)稳定。
封端:用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起来,以减少残留的硅醇基,减轻待测组分与酸性硅羟基反应而引起的色谱峰拖尾现象。尤其对于极性样品而言,未封端处理的色谱柱分离效果较差。
现在商品化的液相色谱柱琳琅满目,根据色谱柱的参数可以给我们提供一个初步的选择,但由于各个仪器厂商的填料技术和键合技术都有差异,即使都是C18柱,同一品牌不同系列都有不同的功能,有能耐受低pH值的、有耐高温的、有适合碱性样品的等等。所以在选择色谱柱前要好好研究色谱柱参数,仔细阅读色谱柱说明书,才能找到合适的色谱柱和适宜的分离方法。
反相色谱柱采用高纯和高机械强度的硅胶,采用先进的键合技术制备而成,色谱柱表面键合率高,覆盖完全,对碱性和酸性化合物具有良好的峰形。
色谱柱柱容量高,寿命长,是一款具有较高性价比的色谱柱。
反相色谱柱性能优点:
(1)在正相和反相中都能有应用
(2)稳定的高覆盖率的单键合相,充分封端球型
(3)较低的疏水性,由于氰基的存在,具有独特的选择性
(4)与裸硅胶不同的选择特性;与裸硅胶柱相比,色谱柱的平衡时间快。
反相色谱柱在使用缓冲液的过程中还要注意以下几点:
a.避免使用盐酸盐,盐酸盐对钢质有腐蚀作用;
b.缓冲液zui好要现配现用,往往缓冲液是良好的菌类培养液,隔天或放置长时间实验时会发生很多怪现象;
c.使用缓冲液要及时掌握pH范围,做到胸中有数;
d.清洗液路和柱子时,有温控可加热到30摄氏度易于冲洗;
e.长时间用缓冲溶液要注意观察接头处有无析出,若有白色盐类析出,定期用10%硝酸冲洗液路可以避免液路的堵塞;
f.选择缓冲液要用可靠的试剂,避免不纯的盐类造成不必要的麻烦;过渡流动相是指有机相和水相的组成与分析流动相相同,但是不含缓冲盐的溶液。
反相色谱柱为色谱柱提供方便、经济和有效的保护,延长了色谱柱的寿命,保证分析结果的重现性。
随着使用时间的增加,高效液相色谱柱分离效能下降,柱压增高,其原因主要是由于色谱柱进口段的少量填料被污染引起的,而色谱柱整个柱床并未被破坏,使用保护柱,相当于在色谱柱前增加了一段额外的填料,起到了保护整个色谱柱的作用。
柱填料的物理性能对填料色谱行为有重要影响。
填料主要的物理性能包括如下:颗粒度、孔径、孔体积、键合相化学、含碳量及烷基化处理。
(1)颗粒度是指柱填料的颗粒直径的大小。实际上色谱柱上所标的粒径是一个平均值。
如粒径“5μm”并不是柱中填料所有的颗粒直径都是5μm,实际上有一个颗粒分布度。这种分布度对柱反压及柱效有重要作用。
一般来说,平均颗粒度越小,颗粒分布度越小,色谱柱效越高,反压亦越高。目前C18柱填料粒径在4~10μm之间。
(2)孔径是指填料颗粒间的孔间隙。一般所说的孔径是指填料的平均孔径。
球形填料装柱后平均孔径分布比较窄,柱床结构均匀,柱效高,重现性好;无定形填料平均孔径分布较宽,柱床结构不均匀,流动相线性速度不均匀,谱带扩宽。
平均孔径的大小对分离大分子化合物有较大的影响,在分离含有较大分子的样品时可能会有分子排阻效应,或产生吸附效应从而影响定量的回收率及准确度。
因而在用反相色谱分离诸如蛋白或多肽样品时应考虑选用大孔径(如30 nm)的反相柱填料。
孔体积作为硅胶多孔性的参数,在分离分析较大分子化合物时可作参考,选用较大孔体积的反相柱填料。
(3)化学键合相填料在高效液相色谱法中占有极重要的地位。它可以键合极性较大的有机基团,采用极性较小的溶剂作流动相。
亦可键合极性较小的有机基团,选用极性较大的溶剂作流动相。C18色谱柱是以硅烷化键合型(Si-O-Si-C)存在的,这类键合反应目前应用较为普遍。
如以十八烷基三氯硅烷与全多孔型硅胶M-Porasil-C18反应生成烷基化学键合相,商品名为M-Bondapak-C18
(4)碳含量即填料中的含碳量。传统的测量技术是将填料加热到碳氢键断裂,然后通过测定损失的重量或形成的二氧化碳来计算碳含量。
可以通过增加碳键的长度或增加键合密度来增加碳含量。碳含量增加,柱子的保留值增加。
键合相的色谱行为与键合密度有关,也与硅胶的密度及填料的表面积有关,填料的密度越高,填柱所需的硅胶量越多,柱子的含碳量也越高。
如果用2种不同密度相同碳含量的填料填充柱子,其保留行为将明显不同。因此,单独以碳含量来预测色谱行为是不够的。
(5)C18硅烷化试剂是一个大于2 nm大分子,因此会与已键合在相邻的硅醇基上的C18硅烷化试剂产生严重的立体位阻。
其结果导致在硅胶表面有大量的残留硅醇基没有与硅烷化试剂反应,这些极性的硅醇基在一定色谱条件下会与碱性化合物相互作用引起峰形拖尾,从而可影响定量分析结果。
这些问题在一定程度上可以通过烷基化处理加以克服。烷基化处理是在键合相上完成的独立反应,以减少在硅胶表面的硅醇基。
烷基化处理采用小分子(如三甲硅烷)的试剂,其空间位阻远小于C18基团。大多数固定相仅有30%可覆盖的键合位置。
据报道,通过某些极活跃的化学试剂及特殊的反应条件,最高的覆盖量可达50%。
很好地了解硅胶键合相的物理特性将有助于在高效液相色谱的反应中选择合适的色谱柱。
表面上看C18柱虽然化学官能团相同,而实际上不同品牌的C18柱性能可能有很大差别,从而产生不同的分离结果。