液相色谱仪是一种常见的色谱分析方法,与气相色谱相比液相色谱可以在常温中操作,且不受样品挥发度和热稳定性的限制。这使得液相色谱非常适合相对分子量较大,难汽化,不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物和高聚物的分离分析。
然而要选购一台品质优良的液相色谱并不容易。液相色谱仪的指标很多,有关于泵的、关于检测器的、关于色谱柱的……不过,从选购角度考虑,可以优先考虑噪音、漂移、最小检测浓度、定性定量重复性等主要技术指标。当然,这些指标都要放在系统、回路里去看去比较。
1.噪音
噪音指由仪器的电器元件、温度波动、电压的线性脉冲以及其他非溶质作用产生的高频噪声和基线的无规则波动产生的声音。噪音的大小直接关系到仪器的检测灵敏度,噪音越大检测的灵敏度就越低。对于检测低含量的样品就要求仪器的噪音越小越好,否则噪音过大将会导致基线不稳,甚至影响分析结果;
2.最小检测浓度(最小检测限)
最小检测浓度是反映仪器灵敏度的重要参数。根据公式CL=2×Nd×C/H(CL:最小检测浓度 Nd:噪音 C:样品浓度最小检测浓度 H:样品峰高),最小检测浓度是和噪音成正比的,噪音越大,最小检测浓度就越大,灵敏度就越低。如果选购的仪器回避了这个指标,说明他们不愿在最小检测浓度的基础上去比较噪音;
3.漂移
漂移是指仪器稳定后一段时间内基线漂离原点的距离,通常用来衡量仪器稳定快慢。高品质的仪器能在较短的时间内达到稳定,从而在一定程度上提高分析效率;
4.定性定量重复性
主要是考核仪器稳定性的指标,这对于分析样品来说是非常重要的。好的仪器其稳定性应该是十分不错的,这就要求多次进样保留时间及含量的一致性,这样做出来的结果才能使人信服。虽然这些指标都属于检测器,但是就像前面所说的,条件是要放在整个回路和系统里去看去比较。
例如:泵的脉动会直接影响噪音指标、泵的流量准确度指标,以及密封性不好也会影响相关指标。所以要系统地看指标才可以反应出仪器的一些真实水平。
在选择仪器的时候需要充分考虑到仪器的方方面面才能拿到自己满意的机器。
首先从常规的几个部件做个简单的分析。
(一)输液泵应具备如下性能:
① RSD(流量稳定性)<0.3%;
② 流量范围宽, 0.1~5.0ml/min内连续可调,有的实验则需要更大流量;
③ 输出压一般应能达到150~400 kg/cm2,流量越大,最高压力越低;
④ 液缸容积小,有助于减少流动相死体积,利于清洗。
⑤ 密封性能好,耐腐蚀。
(二)检测器
①紫外检测器,分为可变单波长检测器VWD和二极管阵列检测器DAD,可以检测有紫外吸收的物质
②荧光检测器,检测有荧光的物质
③视差折光检测器,通用型检测器,但对环境要求极为苛刻,而且灵敏度低
④ELSD,蒸发光散射检测器
⑤MSD,质谱检测器
常用的是紫外检测,然后是MSD和ELSD
(三)色谱柱
要求柱效高、选择性好,分析速度快等。目前市场上销售的用于HPLC的各种微粒填料如多孔硅胶以及以硅胶为基质的键合相、有机聚合物微球(包括离子交换树脂)、氧化铝、多孔碳等,其粒度一般为3,5,7,10μm等,柱效理论值可达5~16万/米。
一般的分析只需5000塔板数的柱效;同系物分析500即可;难分离物则可用2万的柱子。
因此一般10~30cm左右的柱长基本能满足复杂混合物分析的需要。所以要根据自己实际情况来选择合适的柱子。
柱效受柱内外因素影响,为使色谱柱达到较佳效率,除柱外死体积要小外,还要有合理的柱结构(尽可能减少填充床以外的死体积)及装填技术。即使可以的装填技术,在柱中心部位和沿管壁部位的填充情况总是不一样的,靠近管壁的部位比较疏松,易产生沟流,流速较快,影响冲洗剂的流形,使谱带加宽,这就是管壁效应。这种管壁区大约是从管壁向内算起30倍粒径的厚度。在一般的液相色谱系统中,柱外效应对柱效的影响远远大于管壁效应。
此外,温度在色谱分析中是个不容忽视的环境条件,环境温度对溶剂的溶解能力、色谱柱的性能、流动相的粘度都有影响。而且不同的检测器对温度的敏感度不一样。保持恒定的温度对实验而言是个绝对不容忽视的条件,因此也要留意注温箱的选择。以保证实验结果的准确性。
(四)进样器
进样装置要求:密封性好,重复性好,死体积小,保证中心进样,进样时对色谱系统的压力、流量影响小。而且进样方式多种多样,可分为隔膜进样、停流进样、阀进样、自动进样。自动进样器则是市场发展的趋势。
(五)数据处理系统
一般专业的液相色谱仪生产厂家都有自己配套的液相色谱仪控制软件。但有不少液相色谱仪可以使用通用型的色谱数据工作站进行数据计算处理。进口软件价格比较高,这个自己得根据资金选择了。
二元泵和四元泵的区别二元有两个泵,泵后混合,气体的溶解度随压力的增大而增大,所以二元高压混合不会产生气泡。四元只一个泵(另外一个是辅泵),是泵前混合,在常压下进行的,两种液体混合时,会降低气体在混合溶液中的溶解度,通常会有气泡产生,所以四元低压梯度系统一定要配在线真空脱气机
高效液相色谱仪分析中进样基线很好,保留时间能锁定,压力也稳定,但是峰面积差别很大,大概有2倍的差别,这种情况出现的原因可能是多方面的,建议采用以下方法解决:
1、调换一根新色谱柱,如果情况一样,则排除柱子的原因。
2、将在线过滤器拆下,用超声波清洗,如果结果一样,说明与在线过滤器无关。
3、考虑是不是进样阀有问题或者定量环堵。建议多进几针样品,看是否有规律,如果没有规律,应检查一下进样器的其他部位,如果是进样器系统出现问题,应尽快解决之。
4、对进样器清洗一下,清洗干净后先进一针空白,再进样,看看结果如何,如果有明显减少,那可能是进样器污染,有样品残留在进样阀体内,在切换的过程中被流动相带入色谱柱。
5、考虑样品溶液是否均匀。建议同一个浓度连续进样5次,看一下结果如何变化,有没有规律;如果是样品溶液不均匀,可以再搅拌一下。
6、考虑光源是不是正常。
7、考虑浓度是否在线性范围内。有时候定量时浓度太高或太低都会产生较大的分析误差。
8、考虑取样方式是否正确,每次取样后是否对针头外面的附着液进行清除。
9、高效液相色谱仪的计算机软件编制可能存在问题。对比可以适当改变软件。
高效液相色谱仪是实验中常见的仪器之一,色谱柱的灵敏度是确保实验准确性的重要原因,那么当色谱柱的灵敏度不够时,我们该如何去解决呢?应该从以下几个方面去分析:
1、样品量不足:解决办法为增加样品量
2、样品未从色谱柱中流出:可根据样品的化学性质改变流动相或柱子
3、样品与检测器不匹配:根据样品化学性质调整波长或改换检测器
4、检测器衰减太多:调整衰减即可。
5、检测器时间常数太大:解决办法为降低时间参数
6、检测器池窗污染:解决办法为清洗池窗。
7、检测池中有气泡:解决办法为排气。
8、记录仪测压范围不当:调整电压范围即可。
9、流动相流量不合适:调整流速即可。
10、检测器与记录仪超出校正曲线:解决办法为检查记录仪与检测器,重作校正曲线。