微量分光光度计能够快速准确的定量检测核酸、蛋白质等溶液。具有使用方便、消耗样品少(仅2μl)、不用预热、能迅速清理残留样品、不需要比色皿或其它样品定位装置、样品不需要稀释等特点,常用于核酸,蛋白定量以及细菌生长浓度的定量,目前已成为众多实验室的常规仪器。
工作原理
超微量分光光度计进行浓度测定的原理是根据朗伯-比尔(Lamber-Beer)定律,A=K·C·L 式中,A为吸光度;K为吸(消)光系数;C为溶液的浓度;L为液层厚度。此公式说明:在入射光一定时,溶液的吸光度与溶液的浓度及液层厚度成正比。此式就是光的吸收定律的数学表达式,又叫朗伯-比尔定律。
核酸定量
核酸的定量是超微量分光光度计使用频率最大的功能。可以定量测定溶于缓冲液的寡核苷酸,单链、双链DNA以及RNA含量。这是由于核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键,具有紫外吸收的特性,最大的吸收波长在260nm,吸收波谷在230nm。
除了核酸浓度,分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度,如A260/A280的比值,用于评估样品的纯度,因为蛋白的吸收峰是280nm。纯净的样品,比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8 或者2.0,表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物,如碳水化合物,多肽,苯酚等,较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。
蛋白质直接定量
这种方法是在280nm波长,直接测试蛋白。蛋白质直接定量方法,适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说,速度快,操作简单;但是容易受到平行物质的干扰,如DNA的干扰;另外敏感度低,要求蛋白的浓度较高。
比色法蛋白质定量
蛋白质通常是多种蛋白质的化合物,比色法测定的基础是蛋白质构成成分:氨基酸(如酪氨酸,丝氨酸)与外加的显色基团或者染料反应,产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关,从而反应蛋白质浓度。
比色方法一般有BCA,Bradford,Lowry 等几种方法。
与传统分光光度计相比,超微量分光光度计要求的样品体积小,不需要比色皿,比色杯清洗方便,只需用干净的吸水纸将样品从检测平台上擦拭干净即可。除此之外,实验过程也更为简单,不需预热,可随时检测,检测结果显示吸光度值的同时,程序直接给出浓度值。超微量分光光度计与传统相比,体积更小,更方便使用。
紫外分光光度计,就是根据物质的吸收光谱研究物质的成分、结构和物质间相互作用的有效手段。紫外分光光度计可以在紫外可见光区任意选择不同波长的光。
问题1:在使用过程中,出现数字显示不能归零,同时伴有图线记录基线位置偏高
可能原因:
①光电倍增等老化,性能降低;
②信号处理板可能发生故障;
③前置放大版出现故障,引起反馈量增大。
解决办法:
①开机通电,先做记录故障曲线,再与原始记录的标准曲线对照,找出异同点,并作一下定性定能分析。然后用一只同型号规格的新光电倍增管替换机上的光电管,再开机实验,结果记录出来的图线并没有什么变化,由此证明光电倍增管没有老化变质。
②进一步检查信号处理板,未发现信号处理板各元器件损坏,对影响灵敏度有关的电位器检测,结果测得数据正常,这说明信号处理板没有故障。
③由于对以上分析,故障发生在前置级放大板可能性很大。应采用模拟测试对前置放大板进行测量,先利用直流稳压电源,把各供电电源加上,使其电路单独工作,用信号发生器发出的信号加到输入端。再用示波器接在输出端测量输出信号,将输入信号与输出信号对比,结果波形相同,说明电路没有故障。用相同方法对一个带驱动器的开关管测量,输入端加入信号后,用示波器未能测出输出端信号,判断开关管坏,换上同一型号规格的开关管,恢复正常。
问题2:仪器扫描样品时,显示一条直线
可能原因:软件出现故障。
解决办法:退出操作系统,重新启动计算机,再次扫描。
问题3:紫外/可见分光光度计接通电源后,光源不亮
可能原因:
①光源灯泡已损坏;
②保险管烧坏。
解决办法:更换氘灯或钨灯;更换保险管。
问题4:仪器噪音比较大
可能原因:光源灯泡使用时间超过寿命期。
解决办法:更换光源灯泡。
问题5:基线的某一段噪音特别高
可能原因:波长段相应的滤光片受潮发霉,严重损失光的能量。
排除方法:更换相应的滤光片。
问题6:仪器自检时提示通讯错误
可能原因:仪器与电脑之间的数据线没有连接好。
解决办法:连接好数据线,重新打开仪器和软件,重新自检。
问题7:自检时提示波长自检出错
可能原因:自检过程中可能打开过仪器样品室的盖子。
解决办法:关上仪器样品室盖子,重新自检。
问题8:测试过程中提示能量太低
可能原因:
①光源灯泡使用时间超过寿命期;
②样池中有不透光的东西挡住了光。
解决办法:更换光源灯泡;拿走挡光的物品
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