1、在不使用时不要开光源灯。如灯泡发黑(钨灯)、亮度明显减弱或不稳定,应及时更换新灯。更换后要调节好灯丝位置。不要用手直接接触窗口或灯泡,避免油污沾附,若不小心接触过,要用无水乙醇擦拭。
2、单色器是仪器的核心部分,装在密封的盒内,一般不宜拆开。要经常更换单色器盒的干燥剂,防止色散元件受潮生霉。仪器停用期间,应在样品室和塑料仪器罩内放置数袋防潮硅胶,以免灯室受潮,反射镜面有霉点及沾污。
3、吸收池在使用后应立即洗净,为防止其光学窗面被擦伤,必须用擦镜纸或柔软的棉织物擦去水分。生物样品、胶体或其它在池窗上形成薄膜的物质要用适当的溶剂洗涤。有色物质污染,可用3mol/L 盐酸和等体积乙醇的混合液洗涤。
4、光电器件应避免强光照射或受潮积尘。
5、仪器的工作电源一般允许220V±10%的电压波动。为保持光源灯和检测系统的稳定性,在电源电压波动较大的实验室可以配备稳压器。
微量分光光度计能够快速准确的定量检测核酸、蛋白质等溶液。具有使用方便、消耗样品少(仅2μl)、不用预热、能迅速清理残留样品、不需要比色皿或其它样品定位装置、样品不需要稀释等特点,常用于核酸,蛋白定量以及细菌生长浓度的定量,目前已成为众多实验室的常规仪器。
工作原理
超微量分光光度计进行浓度测定的原理是根据朗伯-比尔(Lamber-Beer)定律,A=K·C·L 式中,A为吸光度;K为吸(消)光系数;C为溶液的浓度;L为液层厚度。此公式说明:在入射光一定时,溶液的吸光度与溶液的浓度及液层厚度成正比。此式就是光的吸收定律的数学表达式,又叫朗伯-比尔定律。
核酸定量
核酸的定量是超微量分光光度计使用频率最大的功能。可以定量测定溶于缓冲液的寡核苷酸,单链、双链DNA以及RNA含量。这是由于核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键,具有紫外吸收的特性,最大的吸收波长在260nm,吸收波谷在230nm。
除了核酸浓度,分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度,如A260/A280的比值,用于评估样品的纯度,因为蛋白的吸收峰是280nm。纯净的样品,比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8 或者2.0,表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物,如碳水化合物,多肽,苯酚等,较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。
蛋白质直接定量
这种方法是在280nm波长,直接测试蛋白。蛋白质直接定量方法,适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说,速度快,操作简单;但是容易受到平行物质的干扰,如DNA的干扰;另外敏感度低,要求蛋白的浓度较高。
比色法蛋白质定量
蛋白质通常是多种蛋白质的化合物,比色法测定的基础是蛋白质构成成分:氨基酸(如酪氨酸,丝氨酸)与外加的显色基团或者染料反应,产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关,从而反应蛋白质浓度。
比色方法一般有BCA,Bradford,Lowry 等几种方法。
与传统分光光度计相比,超微量分光光度计要求的样品体积小,不需要比色皿,比色杯清洗方便,只需用干净的吸水纸将样品从检测平台上擦拭干净即可。除此之外,实验过程也更为简单,不需预热,可随时检测,检测结果显示吸光度值的同时,程序直接给出浓度值。超微量分光光度计与传统相比,体积更小,更方便使用。
分光光度计通常是光源、单色器、样品室、检测器和显示仪表或记录仪组成。
(1)光源:
一般采用钨(350-2500nm,可见光用)和氖灯(190-400nm,紫外光用),根据不同的波长要求选择使用。
(2)单色器:
从光源发射的复合光中分出单色光的光学装置。单色器由入射狭缝、准直元件、色散元件、聚焦元件和出射狭缝等五部分组成。常用的色散元件有棱镜和光栅。
(3)棱镜:
根据不同波长的光通过棱镜时具有不同的折射率,从而将复合光按波长顺序分解为单色光的一种色散元件。山玻璃或石英制成。玻璃棱镜适于装备工作波长为350-800rim的光度计,高质量的石英可透过185nm的紫外光,且对200-400nm的光有很高的色散率,但对可见光的色散却很低,因此石英棱镜适用于紫外光区。之光栅。利用光的衍射与干涉作用制成的一种色散元件。光谱仪中多采用平面闪耀光栅,它山高度抛光的表面上刻画许多根平行线槽而成。一般为60(〕条/nun,1200条/mm,多的可达2400条/mm,甚至更多。当复合光照射到光栅上时,光栅的侮条刻线都产生衍射作用,衍射的光又互相干涉从而产生干涉条纹。光栅正是利用丙酮波长的入射光产生的干涉条纹的衍射角不同,波长长的衍射角大,波长短的衍射角小,从而使复合光色散成按波长顺序排列的单色光。
(4)样品室:
样品室内装有吸收池架。吸收池山玻璃或石英制成,有不同形状和光程长。玻璃吸收池只能用于可见光区,而石英池既可用于可见光区、亦可用于紫外光区。
(5)检测器:
检测器是一种光电转换元件,其作用是将透过吸收池的光信号变成可测量的电信号。目前,在可见.紫外光度计中多用光电管和光电倍增管。
(6)显示仪表和记录仪:
早期的光度计多采用检流计、微安表作显示装置,直接读出吸光度或透光率。近代的光度计多采用数字电表等显示和用X-Y记录仪直接绘出吸收曲线,并配有计算机数据处理台。