在日常分离分析工作中，色谱柱的正确使用和维护十分重要，色谱柱使用是否得当，直接影响色谱柱的寿命，在色谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱。
1、柱子在装卸、更换时，动作要轻，接头拧紧要适度。必须防止较强的机械振动，以免柱床产生空隙。
2、如果仪器用来做常规分析，样品种类有限，但分析次数多，则不妨为每一类常规分析配置一根专用柱，这样有助于延长柱子的寿命。
3、避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况;柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓。
4、应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。
5、如使用柱温控制装置时，应注意在通人流动相后才能升温。
6、一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。
7、选择使用适宜的流动相，以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一个预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶“饱和”，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。
8、避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注人柱内，需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一个保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱。保护柱可以而且应该经常更换。
9、 经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右，即常规分析需要50-75mL。
10、保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。
11、色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗;另一种可能是大分子进人柱内，使柱头被污染;如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。
12、在完成分离分析工作之后，不应立即停机，需及时对色谱分析系统进行冲洗，一般0.5h以上，以除去色谱柱内的杂质。
通常一根色谱柱在分析数千个样品之后性能仍然保持良好，但也有的柱仅分析不多的样品后几乎就报废了。影响柱寿命和其它问题的因素很多，而有些因素是操作者很难控制的，如果被分析的样品(如分析生物样品)，怎么净化样品也是“脏”的，好于色谱柱的影响是非常大的。然而采取下列措施后，在多数情况下总能够人为地减少柱上故障，达到延长柱寿命的目的。
加流路过滤器和保护柱
流路过滤器紧靠进样阀后面，位于分析柱前。0.5μm烧结不锈钢片夹在死体积很小的套子中，挡住来源于样品和进样阀垫圈的微粒入柱。因为每个样品都过滤既费事又带来误差，样品量少过滤更困难，因此流路上装过滤器是比较省事的办法。也可以在流路加上保护柱，放在流路过滤器和分析柱之间，或者代替流路过滤器。保护柱的使命是收集阻塞柱进口的来自样品的化学“垃圾”。这程垃圾最终隐藏低柱效能。保护柱应该是小体积，用分析柱的同种填料填装。保护柱使用得当，对分离无影响，好像未装保护柱一样。有些厂商的商品将保护柱都是用短柱、不超过3cm长，内径2～3mm，用较大粒度的填粒(15～20μm)干法填装，会使分析柱的效能有所降低。
避免高压冲击
一般色谱柱都能经得起高压，但经不起突然变化的高压冲击。引起高压突然冲击，主要是因样品阀的缓慢转动、泵起动快，柱切换操作等。等面已讨论过，转动六通进样阀时从泵到柱的液流会瞬时切断。在阀的泵侧压力升高，在阀的柱侧压力降低(变化超过20%)。阀转到底后压力突然冲击一下恢复正常，手动进样阀的变化不大，自动进样阀比较慢，可能造成压力冲击，可用氦气代替空气驱动进样阀。因氨压缩系数小。另外泵起动不应过快，可分步操作。如用3ml/min流速，先从1mL/min到2mL/min，然后再3ml/min，每个间隔应大于20s。
柱切换技术的应用也很广泛，切换过程中在色谱柱的入口处压力在零到很大数字之间变化，会很快使柱报废。
柱填料的物理性能对填料色谱行为有重要影响。
填料主要的物理性能包括如下：颗粒度、孔径、孔体积、键合相化学、含碳量及烷基化处理。
(1)颗粒度是指柱填料的颗粒直径的大小。实际上色谱柱上所标的粒径是一个平均值。
如粒径“5μm”并不是柱中填料所有的颗粒直径都是5μm，实际上有一个颗粒分布度。这种分布度对柱反压及柱效有重要作用。
一般来说，平均颗粒度越小，颗粒分布度越小，色谱柱效越高，反压亦越高。目前C18柱填料粒径在4～10μm之间。
(2)孔径是指填料颗粒间的孔间隙。一般所说的孔径是指填料的平均孔径。
球形填料装柱后平均孔径分布比较窄，柱床结构均匀，柱效高，重现性好；无定形填料平均孔径分布较宽，柱床结构不均匀，流动相线性速度不均匀，谱带扩宽。
平均孔径的大小对分离大分子化合物有较大的影响，在分离含有较大分子的样品时可能会有分子排阻效应，或产生吸附效应从而影响定量的回收率及准确度。
因而在用反相色谱分离诸如蛋白或多肽样品时应考虑选用大孔径(如30 nm)的反相柱填料。
孔体积作为硅胶多孔性的参数，在分离分析较大分子化合物时可作参考，选用较大孔体积的反相柱填料。
(3)化学键合相填料在高效液相色谱法中占有极重要的地位。它可以键合极性较大的有机基团，采用极性较小的溶剂作流动相。
亦可键合极性较小的有机基团，选用极性较大的溶剂作流动相。C18色谱柱是以硅烷化键合型(Si-O-Si-C)存在的，这类键合反应目前应用较为普遍。
如以十八烷基三氯硅烷与全多孔型硅胶M-Porasil-C18反应生成烷基化学键合相，商品名为M-Bondapak-C18
(4)碳含量即填料中的含碳量。传统的测量技术是将填料加热到碳氢键断裂，然后通过测定损失的重量或形成的二氧化碳来计算碳含量。
可以通过增加碳键的长度或增加键合密度来增加碳含量。碳含量增加，柱子的保留值增加。
键合相的色谱行为与键合密度有关，也与硅胶的密度及填料的表面积有关，填料的密度越高，填柱所需的硅胶量越多，柱子的含碳量也越高。
如果用2种不同密度相同碳含量的填料填充柱子，其保留行为将明显不同。因此，单独以碳含量来预测色谱行为是不够的。
(5)C18硅烷化试剂是一个大于2 nm大分子，因此会与已键合在相邻的硅醇基上的C18硅烷化试剂产生严重的立体位阻。
其结果导致在硅胶表面有大量的残留硅醇基没有与硅烷化试剂反应，这些极性的硅醇基在一定色谱条件下会与碱性化合物相互作用引起峰形拖尾，从而可影响定量分析结果。
这些问题在一定程度上可以通过烷基化处理加以克服。烷基化处理是在键合相上完成的独立反应，以减少在硅胶表面的硅醇基。
烷基化处理采用小分子(如三甲硅烷)的试剂，其空间位阻远小于C18基团。大多数固定相仅有30%可覆盖的键合位置。
据报道，通过某些极活跃的化学试剂及特殊的反应条件，最高的覆盖量可达50%。
很好地了解硅胶键合相的物理特性将有助于在高效液相色谱的反应中选择合适的色谱柱。
表面上看C18柱虽然化学官能团相同，而实际上不同品牌的C18柱性能可能有很大差别，从而产生不同的分离结果。
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