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分光光度计的工作原理 光度计工作原理

时间:2020-05-15    来源:仪多多仪器网    作者:仪多多商城     

    事实上,分光光度计的设计原理和工作原理,允许吸光值在一定范围内变化,即仪器有一定的准确度和精确度。如EppendorfBiophotometer的准确度≤1.0%(1A)。这样多次测试的结果在均值1.0%左右之间变动,都是正常的。另外,还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的pH值,离子浓度等:在测试时,离子浓度太高,也会导致读数漂移,因此建议使用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液,如TE,可大大稳定读数。样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素:由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒,尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响,要求核酸吸光值至少大于0.1A,吸光值可以在0.1-1.5A。在此范围内,颗粒的干扰相对较小,结果稳定。从而意味着样品的浓度不能过低,或者过高(超过光度计的测试范围)。最后是操作因素,如混合要充分,否则吸光值太低,甚至出现负值;混合液不能存在气泡,空白液无悬浮物,否则读数漂移剧烈;必须使用相同的比色杯测试空白液和样品,否则浓度差异太大;换算系数和样品浓度单位选择一致;不能采用窗口磨损的比色杯;样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。

    除了核酸浓度,分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度,如A260/A280的比值,用于评估样品的纯度,因为蛋白的吸收峰是280nm。纯净的样品,比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8或者2.0,表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物,如碳水化合物,多肽,苯酚等,较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品,A320一般是0。

    蛋白质的直接定量(UV法)

    这种方法是在280nm波长,直接测试蛋白。选择Warburg公式,光度计可以直接显示出样品的浓度,或者是选择相应的换算方法,将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单,先测试空白液,然后直接测试蛋白质。由于缓冲液中存在一些杂质,一般要消除320nm的“背景”信息,设定此功能“开”。与测试核酸类似,要求A280的吸光值至少大于0.1A,较佳的线性范围在1.0-1.5之间。实验中选择Warburg公式显示样品浓度时,发现读数“漂移”。这是一个正常的现象。事实上,只要观察A280的吸光值的变化范围不超过1%,表明结果非常稳定。漂移的原因是因为Warburg公式吸光值换算成浓度,乘以一定的系数,只要吸光值有少许改变,浓度就会被放大,从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法,适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说,速度快,操作简单;但是容易受到平行物质的干扰,如DNA的干扰;另外敏感度低,要求蛋白的浓度较高。

    比色法蛋白质定量

    蛋白质通常是多种蛋白质的混合物,比色法测定的基础是蛋白质构成成分:氨基酸(如酪氨酸,丝氨酸)与外加的显色基团或者染料反应,产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关,从而反应蛋白质浓度。

可见分光光度计光源及信号部分故障问题

  一.光源部分:

  (1)故障:钨灯不亮;

  原因:钨灯灯丝烧断(此种原因几率最高);

  检查:钨灯两端有工作电压,但灯不亮;取下钨灯用万用表电阻档检测。

  处置:更换新钨灯;

  (2)故障:氘灯不亮;

  原因:氘灯起辉电路故障;

  检查:氘灯在起辉的过程中,一般是灯丝先要预热数秒钟,然后灯的阳极与阴极间才可起辉放电,如果灯在起辉的开始瞬间灯内闪动一下或连续闪动,并且更换新的氘灯后依然如此,有可能是起辉电路有故障,灯电流调整用的大功率晶体管损坏的几率最大。

  处置:需要专业人士修理;

  二.信号部分:

  (1)故障:没有任何检测信号输出;

  原因:没有任何光束照射到样品室内;

  检查:将波长设定为530nm,狭缝尽量开到最宽档位,在黑暗的环境下用一张白纸放在样品室光窗出口处,观察白纸上有无绿光斑影像;

  处置:检查光源镜是否转到位,双光束的切光电机是否转动了(耳朵可以听见电机转动的声音);

  (2)故障:样品室内无任何物品的情况下,全波长范围内基线噪声大;

  原因:光源镜位置不正确、石英窗表面被溅射上样品;

  检查:观察光源是否照射到入射狭缝的中央?石英窗上有无污染物?

  处置:重新调整光源镜的位置,用乙醇清洗石英窗;

  (3)故障:样品室内无任何物品的情况下,仅仅是紫外区的基线噪声大;

  原因:氘灯老化、光学系统的反光镜表面劣化、滤光片出现结晶物;

  检查:可见区的基线较为平坦,断电后打开仪器的单色器及上盖,肉眼可以观察到光栅、反光镜表面有一层白色雾状物覆盖在上面;如果光学系统正常,最大的可能是氘灯老化,可以通过能量检查或更换新灯方法加以判断;

  处置:更换氘灯、用火棉胶粘取镜面上的污物或用研磨膏研磨滤光片(注意:此种技巧需要有一定维修经验者来实施);

  (4)故障:样品室放入空白后做基线记忆,噪声较大,紫外区尤甚;

  原因:比色皿表面或内壁被污染、使用了玻璃比色皿或空白样品对紫外光谱的吸收太强烈,使放大器超出了校正范围;

  检查:将波长设定为250nm,先在不放任何物品的状态下调零,然后将空比色皿插入样品道一侧,此时吸光值应小于0.07Abs;如果大于此值,有可能是比色皿不干净或使用了玻璃比色皿;同样方法也可判断空白溶液的吸光值大小;

  处置:清洗比色皿,更换空白溶液;

  (5)故障:吸光值结果出现负值(常见);

  原因:没做空白记忆、样品的吸光值小于空白参比液;

  检查:将参比液与样品液调换位置便知;

  处置:做空白记忆、调换参比液或用参比液配置样品溶液;

  (6)故障:样品信号重现性不良;

  原因:排除本身的原因外,最大的可能是样品溶液不均匀所致;在简易的单光束仪器中,样品池架一般为推拉式的,有时重复推拉不在同一个位置上;

  检查:更换一种稳定的试样判定;

  处置:采取正确的试样配置手段;修理推拉式样品架的定位碰珠;

  (7)故障:做基线扫描或样品扫描时,基线或信号有一个大的负脉冲;

  原因:扫描速度设置得过快,信号在读取时,误将滤光片或光源镜的切换当做信号读取了;

  检查:改变扫描速度;

  (8)故障:做基线扫描或样品扫描时,基线或信号有一个长时间段的负值或满屏大噪声;

  原因:滤光片饲服电机“失步”,造成档位错位,国产电机尤甚;

  检查:重新开机有可能回复,或打开单色器对照波长与滤光片的相对位置来检查(注意:打开单色器时要保护检测器不被强光刺激);

  处置:更换饲服电机;

  (9)故障:样品出峰位置不对;

  原因:波长传动机构产生位移;

  检查:通过氘灯的656.1nm的特征谱线来判断波长是否准确;

  处置:对于高档仪器而言处理手段相对简单,使用仪器固有的自动校正功能即可;而对于相对简单的仪器,这种调整则需要专业人员来进行了;

  (10)故障:信号的分辨率不够,具体表现是:本应叠加在某一大峰上的小峰无法观察到;

  原因:狭缝设置过窄而扫描速度过快,造成检测器响应速度跟不上,从而失去应测到的信号;按常理,一定的狭缝宽度要对应一定范围的扫描速度;或者狭缝设置得过宽,使仪器的分辨率下降,将小峰融合在大峰里了。

  检查:放慢扫描速度看一看或将狭缝设窄;

  处置:将扫描速度、狭缝宽窄、时间常数三者拟合成一个优化的条件;

  (11)故障:当仪器波长固定在某个波长下时,吸光值信号上下摆动,特别是测量模式转换为按键开关式的简易仪器;

  原因:开关触点因长期氧化所致造成接触不良;

  检查:用手加重力量按琴键时,吸光值随之变化;

  处置:用金属活化剂清洗按键触点即可;

  (12)故障:仪器零点飘忽不定,主要反映在简易仪器上;

  原因:在简易仪器中,零点往往是通过电位器来调整,这种电位器一般是炭膜电阻制作的,使用久了往往造成接触不良;

  处置:更换电位器;

  还有一点补充一下,如果是PC连接UV时,同志们一定注意接口板别不小心被击穿,一定要关机后拔插.若可见部分稳定性不好,有可能是钨灯的供电电压不稳,一般钨灯电源是稳压电路。

标签: 光度计
光度计 可见分光光度计光源及信号部分故障问题_光度计

双光束分光光度计的特点

  双光束分光光度计成功实现了高精度和高可靠性测量的严格要求,可满足各种应用的要求,可用在生物研究、生物工业、药物分析、制药、教学研究、环保、食品卫生、临床检验、卫生防疫等领域。

  双光束分光光度计的特点:

  1、测量数据可通过打印机输出,具有USB接口

  2、可断电保存测量参数和数据,方便用户使用

  3、宽广的波长范围,可满足各个领域对波长范围的要求

  4、全自动的设计理念,实现了zui简单的测量手段

  5、大规模集成电路的设计大大提高了系统的扩展性和可靠性

  6、改良优化的光路设计、进口光源和接收器造就了系统高性能和高可靠性

  7、丰富的测量方法,具有波长扫描、时间扫描、多波长测定、多阶导数测定(选)、双波长、三波长(选)DNA蛋白质测量(选)等多种测量方法,可满足不同测量的要求,并可在6英寸大屏幕上直接显示

  8、根据用户的要求可选配单孔架、手动四连架、手动八连架、自动八连架、玻璃支架、试管架、1cm比色架、5cm比色架、10cm比色架等

  9、可通过PC控制实现更精确和灵活的测量,可满足不同用户的需求。

标签: 双光束分光光度计
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