紫外及可见光分光光度计的可测波长范围为200一1000 nm,也有波长范围为200- 400 nm的紫外分光光度计,但前者较为普遍。紫外及可见光分光光度计的构造原理与可见光分光光度计(如721型分光光度计)相似。由于玻璃吸收紫外光,因此单色器要用石英棱镜或光栅。 (一)光(light source) 有钨丝灯及氢灯(或氛灯)两种。可见光区(360一1000 nm)使用钨丝灯;紫外光区 (200一360 nm)则用氢灯或氛灯。 (二)吸收池(absorption cell) 由于玻璃吸收紫外光.吸收池要用石英材质。 (三)检浏器(detector) 检侧器使用两只光电管,一为氧化艳光电管,用于625一1000 nm波长范围;另一只是锑艳光电管,用于200一625 nm波长范围。光电倍增管亦为常用的检测器,其灵敏度比一般的光电管高2个数量级。 紫外及可见光分光光度计分单光束和双光束型。单光束型仪器使用前一般需要预热以使仪器稳定,缺点是难以消除与补偿由于光源与电子测量系统不稳定等所引致的误差。双光束型仪器能够消除与补偿由于光源、电子测量系统不稳定等所引致的误差,所以其测盘的精确度就提高了。 其工作原理可描述为:由光源(钨丝灯氘灯,根据波长而变换使用)发出的光经人口狭缝及反射镜反射至石英棱镜或光栅,色散后经过出口狭缝而得到所需波长的单色光束。然后由反射镜反射至由马达转动的调制板及扇形镜上。当调制板以一定转速旋转时,时而使光束通过,时而挡住光束,因而调制成一定频率的交变光束。之后扇形镜在旋转时,将此交变光束交替地投射到参比溶液(空白溶液)及试样溶液上,后面的光电倍增管接受通过参比溶液及为试样溶液所减弱的交变光通量,并使之转变为测量信号。此信号经放大并用解调器分离及整流,然后以电位器自动平衡此两直流信号的比率,并依照记录器记录得到吸收曲线。
由于分光光度计是一种常用的实验室分析仪器,款式和价格都是多样化的,因此如何选择一款合适的分光光度计就显得尤为重要了。下面简单说一下如何选择分光光度计。
一、选择可满足使用者长期分析要求的仪器即可:
尽管分光光度计种类繁多,但不外乎:简易型、中档型和高档型三大类;
(1)简易型仪器及其特点:
结构:这种类型的仪器多为单光束型,即只有一束光照射到样品室内;光源一般仅有钨灯;样品支架一般为推拉式四联池架;波长选择多为手动查找,重复性差;狭缝为一个固定宽度模式;光学性能指标较低;检测器多为光敏二极管;显示器多为机械表头或数码管显示器,数据处理器一般没有。此类仪器生产以国内厂家居多。
测量模式:多为定点(固定波长)吸光度或透过率测量方式,基本不能进行波长扫描测量。
适应范围:小型实验室及示范教学,分析样品相对简单,测试结果精度要求不高。
(2)中档型仪器及其特点:
结构:此类仪器多为双光束型或准双光束型,但也有单光束仪器型;光源有钨灯和氘灯;样品池支架为两个固定式,分别是样品通道和参比通道;波长按照设定模式自动查找或扫描;狭缝多数仍为2nm固定宽度模式,也有1.5nm狭缝宽度的;检测器多数是硅光二极管,但也有少数用光电倍增管的;光学性能相对较高,其中光栅的技术指标尤为重要,较佳的光栅为凹面型,为此无论在分辨率还是在杂散光方面指标要优于简易型仪器;显示器为液晶式或连接电脑,数据处理可由仪器自身具有的或外接计算机处理。并有一定的测量附件。
测量模式:透过率、吸光度、浓度直读、单光束;单点及扫描均可。
适应范围:此类仪器基本可满足大多实验室分析需要。
(3)高档型仪器及特点:
除了中档仪器的特点外,主要是光学系统的设计和制造工艺水平更高了,比如使用了大尺寸的凹面光栅,并且光栅刻槽数大于1800条/mm;波长检测范围有的仪器在近红外区已经超过1100nm,可达到2600nm;狭缝均为连续可调型,以适应高分辨率的需要,波长扫描速度的档位也增加了,检测器均使用高灵敏度的光电倍增管和红外检测器;数据处理目前基本是电脑来执行;衡量一台仪器的另外一个指标是看此仪器是否具有丰富的附属测量器件,如偏振附件、积分球附件、反射附件、自动进样器附件、色度分析软件、薄膜附件等等。
测量模式:透过率、吸光度、浓度直读、反射方式、能量方式,单点、扫描均可;
适应范围:科研、光学产品的检测、生化样品检测、复杂样品检测等。不但可以测液态样品,也可测固态样品。
分光光度计就是利用分光光度法对物质进行定量定性分析的仪器。由于核酸,蛋白定量以及细菌生长浓度的定量样本量很小,于是超微量分光光度计应运而生。超微量分光光度计近年来已经替换普通的分光光度计成为分子生物学实验室的新宠,广泛应用于生命科学实验室蛋白质组学和基因组学等领域。
超微量分光光度计与传统分光光度计相比,前者具备的独特优点在于:
(1)所需样品体积小,仅需0.5—2μl;
(2)不需要比色皿,用移液枪直接将样品滴加到检测平台上,测量时样品自动形成液柱,检测完成后只需用干净的吸水纸将样品从检测平台上擦拭干净即可,避免了因为比色皿清洗不净带来的交叉污染;
(3)一般具有多个光程(电机控制自动选择)【BIO-DLMicroDrop基座模式下光程1.0mm、0.2mm、0.1mm和0.05mm自动调整】,而传统分光光度计的光程为10mm,超微量分光光度计样品无需稀释,测量范围可达到常规分光光度计的50倍【BIO-DLMicroDrop基座模式下dsDNA检测范围:2~15000ng/μl】;
(4)氙气闪光灯为灯源,代替了氘灯(紫外)和钨灯(可见),使用寿命更长;
(5)不需要预热,可随时检测,检测时间短【BIO-DLMicroDrop<5秒】;
(6)显示吸光度值的同时,程序直接给出浓度值(核酸、蛋白和荧光染料);
(7)占据实验室空间体积比传统分光光度计小很多【BIO-DLMicroDrop重量:2.1kg】