定量分析和定性分析是分光光度计的两大主要功能,特别是定量分析。其它的分析都应该是从这两大种功能中发展出来的。下面来详细介绍介绍:
(1)定量分析
根据琅伯-比尔定律,样品的浓度和吸光度是成正比关系的,浓度越大,吸收值越高,所以分光光度计用的较多的还是定量分析,定量分析的种类有很多,这里介绍常用的几种定量分析方法:
A、绝对法:绝对法是紫外可见分光光度计诸多分析方法中使用较多的一种方法。这是一种以琅伯-比尔定律A=εbC为基础的分析方法,某一物质在一定波长下ε值是一个常数,石英比色皿的光程是已知的,也是一个常数。因此,可用紫外可见分光光度计在λmax波长处,测定样品溶液的吸光度值A。然后,根据琅伯比尔定律求出C=A/εb,则可求出该样品溶液的含量或浓度。
B、标准法:在选定的波长处,在相同的测试条件下,分别测试标准样品溶液C标和被测试样品溶液C样的吸光度A标和A样。然后,按下式求得样品溶液的浓度或含量。
C样=A样/A标×C标
C、标准曲线法
紫外可见分光光度计常用的定量分析方法是标准曲线法。即先用标准物质配制一定浓度的溶液,再将该溶液配制成一系列的标准溶液。在一定波长下,测试每个标准溶液的吸光度,以吸光度值为纵坐标,标准溶液对应得浓度为横坐标,绘制标准曲线。最后,将样品溶液按标准曲线绘制程序测得吸光度值,在标准曲线上查出样品溶液对应的浓度或含量。
A、其它分析方法
除上述几个分析方法外经常使用的分析方法外,还有比吸收系数法、最小二乘法、解联立方程法和示差分光光度法。
(2)定性分析
如果未知物的紫外吸收光谱的最大吸收峰波长λmax、最小吸收峰波长λmin、最大摩尔吸光系数εmax,以及吸收峰的数目、位置、拐点与标准光谱数据完全一致,就可以认为是同一种化合物。定性分析的主要目的是知道分析样品中是什么物质。
荧光分光光度计与紫外分光光度计属一类产品,结构均由激发光源、单色器、样品室、光电倍 增管和读出(记录)装置所组成。但是它们光源是不同的,荧光分光光度计多采用高压汞灯、氙灯和激光光源。同时,荧光测量多采用激发光和发射光成直角的光路,仪器组件的布置有所不同。 下图为某型号荧光分光光度计的光学系统图,其主要工作原理是:当光源光束经入射单色器色散,提取所需波长单色光照射于样品上,由样品发出的荧光经发 射单色器色散后照射于光电倍增管,光电倍增管把荧光强度信号转化成电信号并经放器放大后记录或读出信号。
荧光分光光度计的光学系统图
1.氙灯(150W);2.透镜;3.光束分裂器;4.水平狭缝;5.激发单色器光栅;6.参考放电管;7.关闸;8.样品室关闸;10.发射单色器光栅;12.光电倍增管 (1)激发光源:要比吸收法中光源强度大。 汞灯:发射强度大、稳定,不需复杂电源,但谱线不连续,数目少,主要用于滤片荧光计。 碘钨灯:提供连续光谱300~700mn。 氙灯:发出射线的强度大,谱线连续,分布于200~700 nm光域内,且在300~400nm 波段内射线强度几乎相等,但该灯的电源功率要求大,且电源稳定,因此电源结构复杂。 激光:发光强度大,能极大地提高荧光分析的灵敏度。 (2)样品池:通常由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。测量液体时,光源与检测器成直角安排;测量固体时,光源与检测器成锐角安排。低温荧光测定时在一样品池外套一个液氮的透明石英真空瓶。 (3)单色器:荧光分光计通常具有两个滤光片:第一滤光片在光源与样品池之间,滤去不需要的光,让需要的激发光通过。第二滤光片在样品池与检测器之间,滤去溶剂散射 光、容器表面散射光、杂质发出的光等,让待测物质发射的荧光通过。 荧光分光光度计通常具有两个光栅,位置同滤光片,单色性好。 (4)检测器:因荧光通常较弱,采用光电倍增管作检测器,灵敏度高。选择光电倍增管要考虑:响应波长、灵敏度和嗓声水平。 蓝敏管对蛋白质、核酸的测量适用,而红敏管则适用于荧光染料检测。 (5)显示系统:光度表、计算机操作系统等。 补充说明:与紫外分光光度计的结构区别: 1.荧光分光光度计采用的是垂直的测量方式,以消除透射光的影响。 2.检测器前面有无单色器,荧光分光光度计有两个单色器又上图可以看出,能够获得单色性较好的激发光并消除其他杂散光干扰。
正确了解荧光分光光度计的结构,也是能够帮助我们更好使用和操作,一定要仔细阅读哈~
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