在器微型化过程中,尺寸的缩小不仅要考虑材料的性质和制造上的可能,还要从原理上考虑尺寸缩小后所带来的一系列问题。这些问题包括：
（1）分离系统中被分配的分子个数是否大于106,因为只有大于106才能得到符合统计结果的数据;
（2）因分离通道尺寸缩小,自然提高了单位柱长的效率,但是总长度的减少可能使总分离效能远低于常规;
（3）对于质量敏感型检测器,经过分离柱后单位时间内到达检测器的分子个数是否满足检测原理所要求的最小数目;
（4）对于浓度型检测器,到达检测池的分子数目是否能满足符合统计规律的分子数目;
（5）检测微区内的外加能量密度是否超过被检测分子所能承受的极限;
（6）微量流动相的输送与控制;
（7）因材料尺寸的缩小,表面层氧化或腐蚀对器件功能的影响。最后,色谱仪器微型化所带来的好处不仅仅是单位长度分离效率的提高,而是总分离能力的保持甚至提高;不仅仅是分离系统或某个部件的微型化,而是整体的微型化;不仅仅是质量灵敏度的提高,而是浓度灵敏度的保持或提高;不仅仅是能量和物质的低消耗,而是使用的方便和友好;不仅仅是整体尺寸的缩小,更重要的是整机的稳定性和可靠性的提高!
下面分别讨论上述7个问题。
（1）色谱分离的基本原理是有符合统计规律数目的分子群经过不断的两相分配和分子碰撞,利用其分配系数的差异来达到分离的目的。这是一个宏观参数。当分子数目低于这个数目时,就会偏离统计规律而出现所谓的涨落现象。分子数目越少,涨落现象越严重。当分子数目低于103个时,已没有准确的色谱保留规律,因此也就失去了宏观意义下的分离规律。一般地,保证符合统计规律的分子数目是106个。
例如内径30μm的填充毛细管液相色谱（μ2HPLC）柱或毛细管电泳柱,若分别保持10万/m和40万/m的分离柱效,直接进样时不过载的进样量分别为40pL（1pL=10-12L）和115pL,分子总数分别是112×1012～112×1014和415×1010～415×1012。样品中含量低至1～0.01μL/L（对μ2HPLC）或低至20～0.2μL/L（对CE）的组分就不能满足106个分子的数目要求,分离过程中就会出现上述问题。所以,上述分离系统对浓度高于这个指标的样品分离时可以有重复的保留时间。如果考虑检测方面的限制[参见下述的（3）和（4）>,痕量分析中用粗内径的填充色谱柱总是优于微型色谱柱。
为了能进行痕量分析,微型分离分析系统往往采用样品预浓缩技术以补偿浓度灵敏度的不足。但为此而发展的技术也同样适用于常规分离分析系统,同样可以提高常规仪器的灵敏度,除非样品量受到严格限制。
（2）45年前的色谱柱理论已经指出,毛细管开口柱的内径越小,或填充柱的填料粒度越小,色谱柱的分离效率就越高。毛细管电泳亦然,只是理论上有些不同,如有散热问题和塞子流型的特点。微型化中普遍采用的细内径分离柱并不是微型仪器的专利,所能达到的高柱效也不是最近才认识到的。如果在现有常规仪器中使用这种等效内径的色谱柱,再适当改进进样技术和检测器,就会有与微型色谱或芯片电泳同样的单位柱长的柱效,同时还可以有极高的总分离效能,因为常规仪器中分离柱的长度很少受限,而高的分离效能才是真正有意义的。所以,微型色谱和芯片毛细管电泳用短分离柱而有快速分离的特点,并不是它真正的优点,因为用同样尺寸的分离柱可以分别在常规色谱和毛细管电泳上实现同样的效果。
高效液相色谱仪适宜于分离、分析高沸点、热稳定性差、有生理活性及相对分子量比较大的物质，因而广泛为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中针对这种精密而又运用广泛的科学仪器。
下面我们来聊一聊基线。HPLC常见的基线问题主要有基线漂移以及基线噪音。
基线漂移
线漂移基线漂移是色谱工作者普遍遇到的问题。一般说来，机器刚起动时，基线容易漂移，大概要30min的平衡时间，如果用了缓冲溶液、缓冲盐，或者在低波长下(220nm)平衡时间相对会比较长，仍然发现基线漂移，原因可能有以下几种：
1、柱温波动
控制好柱子和流动相的温度，检查是否有打开的窗户或空调对着柱温箱。
2、流通池被污染或有气体
用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池(尽量断开柱子)。如有需要，可以用1N的硝酸(不要用盐酸)。
3、紫外灯能量不足
更换新的紫外灯
4、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成。检查流动相的组成，使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂。
基线噪音
对于紫外检测器,氘灯光源打开后要预热30min以上,基线才能稳定。噪声是指与被测物无关的检测器输出信号的随机扰动变化,分短期噪声和长期噪声两种。
基线噪音(规则的)
产生基线噪音的原因有：在流动相、检测器或泵中有空气;漏液;流动相混合不完全;温度影响(柱温过高,检测器未加热);在同一条线上有其他电子设备;泵振动。
了避免基线噪音,在正式进样之前,需要对流动相脱气;冲洗系统以除去检测器或泵中的空气;检查管路接头是否松动;泵是否漏液;是否有盐析出和不正常的噪音,如有必要,更换泵密封;用手摇动使溶剂混合均匀或使用低粘度的溶剂减少差异或加上热交换器;有其他电子设备时断开LC、检测器和记录仪,检查干扰是否来自于外部,加以更正;泵振动时在系统中加入脉冲阻尼器。
基线噪音(不规则的)
(1)漏液：检查接头是否松动,泵是否漏液,是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要,更换密封,检查流通池是否漏液。
(2)流动相污染、变质或由低质溶剂配成：检查流动相的组成。
(3)流动相各溶剂不相溶：选择互溶的流动相。
(4)检测器/记录仪电子元件的问题：断开检测器和记录仪的电源,检查并更正。
(5)系统内有气泡：用强极性溶液清洗系统;检测器内有气泡,清洗检测器,在检测器后面安装背景压力调节器。
(6)流通池污染(即使是极少的污染物也会产生噪音):用硝酸清洗流通池;
(7)检测器灯能量时不足更换灯;
(8)色谱柱填料流失或阻塞:更换色谱柱。
(9)流动相混合不均匀或混合器工作不正常:维修或更换混合器,在流动相不走梯度时,不建议使用泵的混合装置。
高效液相色谱仪操作步骤如下：
1)过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜.
2)对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。
3)打开hplc工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。
4)进入hplc控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。
5)有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。
6)调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。
7)设计走样方法。
8)进样和进样后操作。
9)关机时，先关计算机，再关液相色谱。
10)填写登记本，由负责人签字。
11)流动相均需色谱纯度，水用20m的去离子水。
12)柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。
13)所有过柱子的液体均需严格的过滤。
14)压力不能太大，可以不要超过2000psi。
高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。
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