高效液相色谱仪的系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。
储液器中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相,被流动相载入色谱柱(固定相) 内,由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数;
在两相中做相对运动时,经过反复多次的吸附-解吸的分配过程,各组分在移动速度上产生较大的差别,被分离成单个组分依次从柱内流出,通过检测器时,样品浓度被转换成电信号传送到记录仪,数据以图谱形式打印出来。
液相色谱仪系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。储液器中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相,被流动相载入色谱柱(固定相)内;
由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数,在两相中作相对运动时,经过反复多次的吸附-解吸的分配过程;
各组分在移动速度上产生较大的差别,被分离成单个组分依次从柱内流出,通过检测器时,样品浓度被转换成电信号传送到记录仪。
高效液相色谱法只要求样品能制成溶液,不受样品挥发性的限制,流动相可选择的范围宽,固定相的种类繁多,因而可以分离热不稳定和非挥发性的、离解的和非离解的以及各种分子量范围的物质。
与试样预处理技术相配合,HPLC所达到的高分辨率和高灵敏度,使分离和同时测定性质上十分相近的物质成为可能,能够分离复杂相体中的微量成分。
随着固定相的发展,有可能在充分保持生化物质活性的条件下完成其分离HPLC成为解决生化分析问题zui有前途的方法。
由于HPLC具有高分辨率、高灵敏度、速度快、色谱柱可反复利用,流出组分易收集等优点,因而被广泛应用到生物化学、食品分析、环境分析、无机分析等各种领域。
液相色谱仪与结构仪器的联用是一个重要的发展方向。
液相色谱柱、特别是高效液相色谱柱的填装,需要有较高的技巧和熟练的技能。因此,有人甚至将“装柱”看作是“艺术加技术”。但是,只要掌握了一些基本的规律和方法,任何实验室都可以填装出具有较高柱性能的色谱柱。当然,目前大多数实验室多是购买商品预填装柱来满足分离、分析之需。但是在一些有特殊需要的情况下,或为节省经费,在实验室中自行填装高效液相色谱柱还是可取的。
液相色谱柱填装程序中应该注意的问题:
①高压操作的安全问题。常发生的问题是柱子与匀浆罐连接不牢,造成加压时柱头被高压冲下或柱子从匀浆罐上滑脱。此时,轻则填装失败,材料损失,重则造成人身伤害事故,一定要加以防范。除每次填装前均须仔细确认是否连接正确且牢靠外,可以还可加上由法兰盘和长螺杆组成的预防脱落装置,以防万一。
②通常,先填装的柱床较后填装的柱床紧密。因此,当使用时宜以相反的方向为宜,即让近匀浆罐一端作为使用时流动相的出口,而填装时的出口端则作为流动相的入口。
③新柱子使用前应以甲醇冲洗20-30min, 后,再改用流动相平衡。
④新柱子宜选适宜的标准样品进行评价并记录,以备存查和比较。