定量分析和定性分析是分光光度计的两大主要功能,特别是定量分析。其它的分析都应该是从这两大种功能中发展出来的。下面来详细介绍介绍:
(1)定量分析
根据琅伯-比尔定律,样品的浓度和吸光度是成正比关系的,浓度越大,吸收值越高,所以分光光度计用的较多的还是定量分析,定量分析的种类有很多,这里介绍常用的几种定量分析方法:
A、绝对法:绝对法是紫外可见分光光度计诸多分析方法中使用较多的一种方法。这是一种以琅伯-比尔定律A=εbC为基础的分析方法,某一物质在一定波长下ε值是一个常数,石英比色皿的光程是已知的,也是一个常数。因此,可用紫外可见分光光度计在λmax波长处,测定样品溶液的吸光度值A。然后,根据琅伯比尔定律求出C=A/εb,则可求出该样品溶液的含量或浓度。
B、标准法:在选定的波长处,在相同的测试条件下,分别测试标准样品溶液C标和被测试样品溶液C样的吸光度A标和A样。然后,按下式求得样品溶液的浓度或含量。
C样=A样/A标×C标
C、标准曲线法
紫外可见分光光度计常用的定量分析方法是标准曲线法。即先用标准物质配制一定浓度的溶液,再将该溶液配制成一系列的标准溶液。在一定波长下,测试每个标准溶液的吸光度,以吸光度值为纵坐标,标准溶液对应得浓度为横坐标,绘制标准曲线。最后,将样品溶液按标准曲线绘制程序测得吸光度值,在标准曲线上查出样品溶液对应的浓度或含量。
A、其它分析方法
除上述几个分析方法外经常使用的分析方法外,还有比吸收系数法、最小二乘法、解联立方程法和示差分光光度法。
(2)定性分析
如果未知物的紫外吸收光谱的最大吸收峰波长λmax、最小吸收峰波长λmin、最大摩尔吸光系数εmax,以及吸收峰的数目、位置、拐点与标准光谱数据完全一致,就可以认为是同一种化合物。定性分析的主要目的是知道分析样品中是什么物质。
双光束紫外-可见分光光度计(以下简称仪器),系指从单色器发出的单色光经光束开关(斩光器)分成为样品和参比两条光束结构的仪器。
它能消除光源不稳和放大器增益变化的影响,并能自动记录和扫描物质的吸收光谱图。
仪器在开机后通常会做一些自检,但仍应按本规程进行检定。仪器的波长范围包括195~800nm,狭缝为0.1~5nm可调。
工作原理
紫外可见分光光度法是利用物质分子对紫外可见光谱区的辐射的吸收来进行分析的一种仪器分析方法。
这种分子吸收光谱产生于价电子能级的跃迁,它广泛用于无机和有机物质的定性和定量分析。
朗伯一一比耳定律(Lambet-Beer)是光吸收的基本定律,俗称光吸收定律,是分光光度法定量分析的依据和基础。
当入射光波长一定时,溶液的吸光度是吸光物质的浓度c及吸收介质厚度(吸收光程)的函数。
其常用表达式如下(式中ε为系数):
A=ε·c·l
紫外见分光光度计是基于紫外可见分光光度法的原理工作的常规分析仪器。根据光路设计的不同,紫外可见分光光度计可以分为单光束分光光度计、双光束分光光度计和双波长分光光度计。
制定依据
本规程主要参照国家计量检定规程《JJG178-2007紫外、可见、近红外分光光度计》、《JJF1641-2017紫外可见分光光度计型式评价大纲》及《中国药典》2015年版四部指导通则“0401紫外-可见分光光度法”拟定。
项目及技术要求
波长准确度≤±1.0nm(紫外光区),≤±2.0nm(500nm附近);
波长重复性≤0.5nm。
基线平直度≤0.01吸光度。
0%线噪声≤0.1%,100%线噪声≤0.5%.
吸光度准确度应符合规定。
杂散光<0.8%。
光谱带宽≤标示带宽±20%。
吸收池配对误差≤0.5%。
检测结果处理
自检结果全部符合技术要求者,即为合格,可以使用。若检测结果不符合规定,应重新调试仪器再进行自检,符合规定后方可使用。