液相色谱柱的使用维护
一、液相色谱柱的基本结构。
液相色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝（封头）与柱填料等组成。
柱管：多用不锈钢制成，若果使用时柱压不高于70 kg/cm2时，也可采用厚壁玻璃或石英管，管内壁要求有很高的光洁度。用于柱填料的装填。
压帽：即色谱柱两端套合于柱管端外壁的塑性圆柱帽，中部有小孔，多为聚四氟乙烯制成，用于固定筛板。
密封环：位于接头螺旋环内壁的弹性环，多为聚四氟乙烯制成，用于色谱柱两端压帽与柱外壁的密封。
二、色谱柱使用前注意事项。
色谱柱在使用前，hao进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。在做柱性能测试时要按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是jia条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同。
1、样品的前处理
a、hao使用流动相溶解样品。
b、使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。
c、使用0.45μm或0.22µm的过滤膜过滤除去微粒杂质。
2、流动相的配制
液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：
a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。
b、流动相与样品不产生化学反应
c、流动相的黏度要尽量小，以便得到好的分离效果；降低柱压降，延长泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。
d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，hao使用对紫外吸收较低的溶剂配制。
e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。
f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。
3、流动相流速的选择
因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求jia柱效，hao使用jia流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1ml／min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml／min为佳。
当选用jia流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。
注意：
a．含水流动相hao在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。hao加入die氮化钠，防止细菌生长。
b．流动相要求使用0.45 μm或0.22µm滤膜过滤，除去微粒杂质。
c．使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能。
三、 色谱柱的使用及维护
1、C18等反相色谱柱使用维护
色谱柱每次使用时一定不要直接使用含无机盐的流动相！
A、建议首先使用含有10～30%乙腈或甲醇的高水相（不含盐）冲洗系统及色谱柱30min以上（如用水-有机相（90：10～95:5），以0.3～0.6ml/min流速冲洗30min以上），再更换为分析流动相。
B、如果流动相中含有缓冲盐，请使用过渡流动相过渡后再换分析流动相平衡；
正确使用缓冲盐，正确使用缓冲盐的目的是防止缓冲盐析出，使用缓冲盐的方法可归结为一句话：使用前要过渡，使用后要冲洗。具体方法如下：
注意：过渡流动相是指有机相和水相比例与分析流动相相同比例，只是不含有缓
冲盐；
阿奇霉素新柱：建议在正常平衡后增加0.1%磷酸/甲醇（90/10）冲洗17小时
C、注意事项。
C.1除 AQ外（可耐100%纯水），其它反相柱应避免使用纯水相，有机相比例建议在5%以上。即使AQ也应避免长时间使用100%水冲洗。如果一定要用100%水作为流动相，请在酸性条件下使用磷酸盐缓冲液，这样能延长色谱柱寿命。
C.2请注意色谱柱的pH、压力耐受范围，如超出范围或变化幅度较大会引起重现性变差、色谱柱提前劣化等问题。
C.3在有机溶剂含量少、色谱柱温度高的条件下，耐酸耐碱性能会降低。
C.4使用含有离子对试剂等表面活性剂的流动相，色谱柱的寿命会变短。
C.5请使用与分析柱相同填料的预柱，否则可能无法得到正常的色谱峰。
C.6.在使用了TFA等强有机酸或碱(pH>8)的流动相之后，请使用与所选用的流动相组成相同的有机溶剂和水的混合溶液进行置换。若是一周以上的长期保存，请进一步使用乙腈进行置换，并用附带的堵头密封，保存在冷暗处。
C.7通常的冲洗可使用高水相-高有机相-有机相（乙腈或甲醇）依次冲洗。在甲醇、乙腈冲洗过程中，重复注入100～200μl四qi呋喃或异丙醇可有助于去除强疏水性物质。
C.8当供试品溶液中含有一定量表面活性剂，多次进样后，由于表面活性剂会在筛板及硅胶表面形成表面膜，导致峰变宽、拖尾甚至分叉。此时，处理方法如下：将色谱柱反向连接接(询问厂家)，不接检测器，用水-乙腈（90：10～95:5），以0.6ml/min流速冲洗2h以上→再用100%乙腈，以0.6ml/min流速冲洗1h以上→然后正向连接好色谱柱，用水-乙腈（90：10～95:5），以1ml/min流速冲洗1h以上→再用100%乙腈，以1ml/min流速冲洗1h以上
2、SCX 氢型阳离子交换柱。
A、每次使用时请一定避免直接使用含无机盐的流动相，避免盐析。可使用高水相过渡后再使用分析流动相。（葡jia胺样品新柱子，用60%乙腈/40水过渡半小时（正常流速即可），后再直接用葡jia胺流动相平衡即可0.2ml流速平衡过液，冲洗也一样先用60%乙腈40水，低流速冲半小时，后转到100乙腈）
B、离子交换柱的平衡时间较反相柱更长，请在分析前保证充分的平衡。
C、.离子交换模式中，洗脱行为一般随以下几点发生大幅变化：
①pH ②盐浓度 ③有机溶剂量 ④盐种类
*为了使样品充分离子化，流动相pHhao与样品的pKa相差 2.0以上
D、短期保存时，请使用含盐的水系流动相来保存；长期保存时，请用出厂（或咨询厂家）流动相纯乙腈来保存。注意拧紧柱两端自带堵头，防止溶剂挥发。
3、NH2色谱柱。
A、每次使用时请注意避免盐析。
B、弱阴离子交换模式中，一般随以下几点洗脱行为发生大幅变化：
①pH ②盐浓度 ③有机溶剂量 ④盐种类
*为了使样品充分离子化，流动相pHhao与样品的pKa相差 2.0以上
C、HILIC模式中，建议使用乙腈作为有机溶液。乙腈量增加，保留能力增大。
D、糖类的分析
①请设定乙腈/水的流动相条件。乙腈的浓度越高，则对糖的保留能力越强。
②若采用含甲醇或缓冲盐的流动相，峰会展宽。
③将其他公司硅胶类NH2色谱柱流动相条件中的乙腈含量增加5vol%，使用我公司NH2柱可重现几乎相同的色谱图。
④若将糖的水溶液作为样品注入，谱峰会展宽。请使用含乙腈50%以上的溶剂来配制糖类样品。
⑤曾在酸性条件下使用过的色谱柱，糖类分析的保留时间、峰形会发生变化。
E、离子型物质的分析
①请设定乙腈/磷酸缓冲液且具有一定pH值的流动相条件。
②考察流动相条件时，按照pH由高到低的顺序进行考察。如果曾经在低pH下使用，填料的表面将无法回到初始状态。
③有时需要长时间平衡色谱柱(24小时以上)。平衡所需时间与通液量和盐浓度紧密相关，因此，时间紧急时请提高流速，或pH不变而增加流动相的盐浓度来进行平衡。
④抗坏血酸的色谱峰有时会出现拖尾现象(样品氧化)。
F、尿囊素的分析
尿囊素在pH 2～8范围内未离子化，请使用磷酸缓冲液作为流动相进行分析。
流动相例：25 mmol/L KH2PO4/ CH3CN = 20 / 80，pH=1.5(H3PO4)
G.一个月以内的保存，请使用与所选用流动相组成相同的有机溶剂和水的混合溶液（不含酸、无机盐）进行置换，请避免只用水进行置换；一个月以上的长期保存，在进行了上述处理之后，请用出厂时的溶剂（乙腈）置换并保存
四、 色谱柱的再生
色谱柱经过一段时间的使用，会出现柱压升高，柱效下降，一种可能是烧结滤片被堵塞；另一种可能是大分子进入柱内， 使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变形，则可能是柱头塌陷，死体积增大。您也可尝试用下面列举色谱柱再生的方法处理色谱柱。
A、反相色谱柱的再生：
用以下溶剂至少各30mL冲洗色谱柱(分析柱)
100%甲醇→100%乙腈→75%乙腈+25%异丙醇→100%异丙醇→100%二氯甲烷→100%己烷→100%异丙醇→75%乙腈+25% 异丙醇→100%乙腈
*若使用己烷或二氯甲烷冲洗色谱柱, 则在重新使用反相流动相以前, 必须用异丙醇冲洗色谱柱!!!
一般情况下 ,极性固定相(如 Si , N H2 , Diol 基色谱填料) 的再生可以依次使用 20～30 倍色谱柱体积的正已烷、异丙醇、二氯甲烷、甲醇冲洗色谱柱(因异丙醇的粘度较大 ,冲洗过程中随时注意调整冲洗流速) ,然后再以相反的溶剂顺序冲洗色谱柱。
高效液相色谱仪是由储液器、泵、进样器、色谱柱、查看器、记录仪等几有些构成。储液器中的活动相被高压泵打入体系，样品溶液经进样器进入活动相，被活动相载入色谱柱（固定相、内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不一样的分配系数，在两相中作相对运动时，经过重复屡次的吸附-解吸的分配进程，各组分在移动速度上发生较大的不一样，被别离成单个组分顺次从柱内流出，经过查看器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱方式打印出来。
高效液相色谱仪常见故障解决方法：
故障1
活动相内有气泡，封闭泵，翻开泄压阀，翻开purge键，清洁脱气，气泡不断从过滤器冒出，进入活动相，不管翻开purge键几回，都无法清除不断发生的气泡。
因素过滤器长时刻沉浸于乙酸铵等缓冲液内，过滤器内部由于霉菌的成长繁衍，构成菌团，阻塞了过滤器，缓冲液难以流畅地经过过滤器，空气在泵的压力作用下经过滤器进入活动相。
处理过滤器浸泡于5%硝酸溶液中，超声清洁几分钟即可；亦可将过滤器浸泡于5%硝酸溶液中12～36小时，悄悄震荡几回，再将过滤器用纯水清洁几回，翻开泄压阀，翻开purge键，清洁脱气，如仍有气泡不断从过滤器冒出，持续将过滤器浸泡于5%硝酸溶液中，如没有气泡不断从过滤器中冒出，阐明过滤器内部的霉菌菌团已被硝酸损坏，活动相能够流畅地经过过滤器。翻开泄压阀，翻开泵，流速调至1.0～3.0ml/min，纯水冲刷过滤器1小时摆布。即可将过滤器清洁洁净。封闭泄压阀，纯甲醇冲刷半小时即可。
故障2
柱压高因素：缓冲液盐分如（乙酸铵等）堆积于柱内；样品污染堆积。
处理关于第一种状况先用40～50℃的纯水,低速正向冲刷柱子，待柱压逐步降低后，相应进步流速冲刷，柱压大幅度降低后，用常温纯水冲刷，之后用纯甲醇冲刷柱子30分钟；关于第二种状况，由样品的堆积导致污染的C18柱，和纯水反向冲刷柱子，然后换成甲醇冲刷，接着用甲醇+异丙醇（4+6）冲刷柱子（冲刷时刻的长短由样品污染的状况而定），再用换成甲醇冲刷，然后用纯水冲刷，最终甲醇冲刷正向冲刷柱子30分钟以上。
故障3
既无压力指示，又无液体流过[1>；。
泵密封垫圈磨损；很多气泡进入泵体。
处理关于第一种状况，替换密封垫圈；关于第二种状况，在泵作用的一起，用一个50ml的玻璃针筒在泵的出口处协助抽出空气。
故障4
压力动摇大，流量不稳定.
因素体系中有空气或者单向阀的宝石球和阀座之间夹有异物，使得两者不能密封。
处理作业中留意调查活动相的量，确保不锈钢滤器沉入储液器瓶底，防止吸入空气，活动相要充沛脱气[2>；。如为单向阀和阀座之间夹有异物，拆下单向阀，放入盛有丙酮的烧杯用超声波清洁.
故障5
出峰欠安，峰分叉。
因素色谱柱被污染；柱头填料陷落。
处理关于第一种状况，先用纯水反向冲刷柱子，然后换成甲醇冲刷，接着用甲醇+异丙醇（4+6）冲刷柱子（冲刷时刻的长短由样品污染的状况而定），再换成甲醇冲刷，然后用纯水冲刷，最终甲醇冲刷正向冲刷柱子30分钟以上。如冲刷后仍然出峰欠安，则考虑第二种状况。关于第二种状况,拧开柱头，查看柱填料是不是硬结或陷落。去掉硬结有些(污染的填料），装入新填料，滴一滴甲醇，填料下陷，再填，用与柱内径一样的顶端滑润的不锈钢杆压紧，再填平，滴甲醇，再压紧重复几回，直至装满填平；。柱头用甲醇冲刷洁净，擦净柱外壁的填料，拧紧柱头，用纯甲醇冲刷30分钟以上。
操作步骤：
1、打开电脑
2、打开主机、预热
3、进入仪器工作站，联机并设定仪器使用方法及仪器参数
4、启动泵的动力系统预处理(排气等)
5、检查是否漏夜、柱压是否正常
6、设置仪器方法，包括仪器的使用条件等
7、激活操作方法，等待仪器平衡、基线平直
8、仪器出现“Ready”后可进行样品分析
9、操作测试结束后，清理所有实验材料，做好清洁卫生
10、记录仪器使用日志，并与管理员办理交接手续
使用注意事项:
1、高效液相色谱的流动相应采用色谱纯溶剂，以满足仪器要求、避免损坏色谱柱;
2、严禁使用有污染的水等冲洗色谱柱，避免将互不相溶的溶剂一同进入泵内;
3、流动相需经过滤、除气后方可使用;
4、待分析的样品必须彻底溶解澄清、过滤，以避免堵塞、损坏色谱柱;
5、分析完成后，须注意及时清洗色谱柱和检测器的比色池。
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