一、液相色谱仪峰分叉怎么回事?
造成这种情况的原因一般是色谱柱被污染,或柱头填料塌陷导致的。
对于*种情况,先用纯水反向冲洗柱子,然后换成甲醇冲洗,接着用甲醇+异丙醇(4+6)冲洗柱子(冲洗时间的长短由样品污染的情况而定),再换成甲醇冲洗,然后用纯水冲洗,zui后甲醇冲洗正向冲洗柱子30分钟以上。如冲洗后依然出峰不佳,则考虑第二种情况。
对于第二种情况,拧开柱头,检查柱填料是否硬结或塌陷。去除硬结部分(污染的填料),装入新填料,滴一滴甲醇,填料下陷,再填,用与柱内径相同的顶端平滑的不锈钢杆压紧,再填平,滴甲醇,再压紧反复几次,直至装满填平。柱头用甲醇冲洗干净,擦净柱外壁的填料,拧紧柱头,用纯甲醇冲洗30分钟以上。
二、如何排除液相色谱仪气泡溢出的故障?
流动相内产生都无法清除不断产生的气泡,主要是因为过滤器长期沉浸于乙酸铵等缓冲液内,过滤器内部由于霉菌的生长繁殖,形成菌团,阻塞了过滤器,缓冲液难以流畅地通过过滤器,空气在泵的压力作用下经过滤器进入流动相。
过滤器浸泡于5%硝酸溶液中,超声清洗几分钟即可;亦可将过滤器浸泡于5%硝酸溶液中12~36小时,轻轻震荡几次,再将过滤器用纯水清洗几次,打开泄压阀,打开purge键清洗脱气,如仍有气泡不断从过滤器冒出,继续将过滤器浸泡于5%硝酸溶液中,如没有气泡不断从过滤器中冒出,说明过滤器内部的霉菌菌团已被硝酸破坏,流动相可以流畅地通过过滤器。打开泄压阀,打开泵,流速调至1.0~3.0ml/min,纯水冲洗过滤器1小时左右。即可将过滤器清洗干净。关闭泄压阀,纯甲醇冲洗半小时即可。
三、自检时,为什么有时会出现“钨灯能量低”的错误?
一般来说,原因是系统中有挡光物,光路偏离,钨灯电源系统或钨灯灯泡已坏。这时首先要检查光度室是否有挡光物;打开检测器光源室盖,检查氘灯是否点亮;如果氘灯不亮,则关机,更换新氘灯,换时,需注意型号;检查氘灯保险丝,看是否松动、氧化、烧断;如果故障,应立即更换;再开机重新自检;若仍出现上述故障,则重新安装软件后再进行自检。
四、出现压力波动大,流量不稳定该怎么办?
造成这种情况的原因是系统中有空气或者单向阀的宝石球和阀座之间夹有异物,使得两者不能密封。处理工作中注意观察流动相的量,保证不锈钢滤器沉入储液器瓶底,避免吸入空气,流动相要充分脱气。如为单向阀和阀座之间夹有异物,拆下单向阀,放入盛有丙酮的烧杯用超声波清洗。
五、液相色谱仪峰面积重复性不好怎么回事?
主要原因可能有进样阀漏液、加样针不到位或液量不足。针对*种情况,处理时应对更换进样阀垫圈;对于第二种情况保证加样针插到底,注射样品溶液后须快速、平稳地从LOAD状态转换到INJECT状态,以保证进样量的准确。日常工作中,液相色谱仪的保养非常重要,如要注意不要让空气进入输液系统和高压泵中,储液器内的溶液如长时间未用应清洗储液器并更换溶液,每次用完色谱仪后缓冲液要用纯水冲洗干净,防止无机盐析出或沉积;样品的前处理也很重要,任何样品都要尽可能地去除杂质,完全溶解,尽量减少对色谱柱的污染,以延长色谱柱的使用寿命,同时避免注射过浓的样品溶液,以免残留液在进样阀内析出固体引起堵塞;色谱柱作好标记,用于不同分析目的的色谱柱不要混用等。
六、液相色谱柱压升高的原因是什么?
造成柱压升高的原因很多。一般是由于柱床内产生了异常的占位性物体,造成流体阻力加大所引起的。例如,缓冲液盐分如(乙酸铵等)沉积于柱内,或样品污染沉积。针对*种情况,处理时应先用40~50℃的纯水,低速正向冲洗柱子,待柱压逐渐下降后,相应提高流速冲洗,柱压大幅度下降后,用常温纯水冲洗,之后用纯甲醇冲洗柱子30分钟;对于第二种情况,由样品的沉积引起污染的C18柱,和纯水反向冲洗柱子,然后换成甲醇冲洗,接着用甲醇+异丙醇(4+6)冲洗柱子(冲洗时间的长短由样品污染的情况而定),再用换成甲醇冲洗,然后用纯水冲洗,zui后甲醇冲洗正向冲洗柱子30分钟以上。
早期使用隔膜和停流进样器,装在色谱柱进口处。现在大都使用六通进样阀或自动进样器。
进样装置要求:密封性好,死体积小,重复性好,保证中心进样,进样时对色谱系统的压力、流量影响小。HPLC进样方式可分为:隔膜进样、停流进样、阀进样、自动进样。
1.隔膜进样。
用微量注射器将样品注进专门设计的与色谱柱相连的进样头内,可把样品直接送到柱头填充床的中心,死体积几乎即是零,可以获得较佳的柱效,且价格便宜,操纵方便。但不能在高压下使用(如10MPa以上);此外隔膜轻易吸附样品产生记忆效应,使进样重复性只能达到1~2%;加之能耐各种溶剂的橡皮不易找到,常规分析使用受到限制。
2.停流进样。
可避免在高压下进样。但在HPLC中由于隔膜的污染,停泵或重新启动时往往会出现“鬼峰”;另一缺点是保存时间不准。在以峰的始末信号控制馏分收集的制备色谱中,效果较好。
3.阀进样。
一般HPLC分析常用六通进样阀(以美国Rheodyne公司的7725和7725i型常见),其关键部件由圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。由于阀接头和连接管死体积的存在,柱效率低于隔膜进样(约下降5~10%左右),但耐高压(35~40MPa),进样量正确,重复性好(0.5%),操纵方便。
4.自动进样。
用于大量样品的常规分析。
流动相相当于液相的血液,可以想象对液相的重要程度。那么流动相都需要注意什么呢? 01、过滤溶剂 溶剂在使用前一定要用0.5μm的过滤器过滤,如果使用固体化学试剂(缓冲盐)配制流动相,过滤特别重要,不能让固体微粒污染泵,阻塞进样器和柱头过滤片。本实验室有水溶性和脂溶性两种过滤膜供选择(反光面朝上),过滤水溶性流动相时(如甲醇/水),先用1~2mL甲醇润湿过滤膜,有助于快速抽滤。 02、保持储液瓶的清洁 用普通溶剂瓶作流动相储液器应不定期废弃瓶子,最后一次应用HPLC级的水或溶剂清洗,不能在清洗过程中留下污迹。 03、保证溶剂的质量 一定要用HPLC级的溶剂,水也应达到HPLC级,同样也要使用高纯度的缓冲盐。 一些因流动相引起的常见问题 01、流动相脱气不充分 流动相受热,或者流动相不同组分混合时会有气体产生,气泡进入泵内引起压力波动,增加噪音,色谱图上出现毛刺。可试用下列方法解决问题:流动相再脱气;采用更有效的脱气方法或两种方法配合使用;改系统内混合为系统外预混合。 02、流动相供给不畅 流动相用完,管道中吸入气体引起泵压力不稳。应经常观察储液器中流动相的量,加足流动相保证所有的样品分析完毕。输液管道上装沉子沉至瓶底,储液器盖上留一小孔正好夹住进液管,使其不能上下移动。 过滤器阻塞引起管道和泵腔空化,压力不稳。过滤器被微粒所阻塞或长霉,去掉过滤器后如果系统运转正常,说明已找出问题,换上新的过滤器则可。有时候换上新的过滤器仍然不畅,那就需要查查流动相的制备过程,或者换大孔径的过滤器。不管如何,流动相都需要重新过滤。 流速过高、阻力大,造成空化现象,这是由于过滤器孔径、管道内径、流速和溶剂黏度等引起的。如果流速大于10mL/min,常会出现这种现象。 使用下列方法解决: (1)使用低流速; (2)换大孔径的过滤器; (3)增加进液管道内径; (4)抬高或加压储液器; (5)不用过滤器,但流动相一定要先过滤; (6)储液器盖子太紧,在储液器内形成真空,打出的流动相不连续。应松开盖子或留有1mm的缝隙; (7)进液管道阻塞或弯曲使泵抽不到液,注意调整进液管道或更换新的。其它问题包括渗漏或接头松动、泵部件损坏等,都能引起供液不正常。 03、流动相和储液器被污染 由于污染,噪音越来越大,检测器基线上升。污染物可能被泵以稳定的浓度打入系统,而再以稳定的浓度流出来,所以在色谱图中不出多余的峰。用梯度洗脱时弱流动相可以使污染物聚在柱顶,流动相强度增加后污染物可能被洗脱出来一个大的伪峰。有时基线噪音突然增大或突然提高,都是因为反复加进新的流动相或系统用得太久(通宵)所造成的。新加进的流动相有污染物或者流动相长霉,繁殖了细菌。 脏的储液器会污染清洁的流动相。每种流动相备有专用的储液器,或者定期报废储液器。 流动相污染来自这几个方面 04、试剂质量不高,玻璃器皿不合格; 微生物的影响; 配制流动相时操作不当等; 因此要求高纯度化学试剂和HPLC级溶剂; 玻璃器皿按规定清洗干净; 为防止微生物生长,每天要用甲醇清洗系统; 怀疑系统内生长了微生物,可用稀硝酸冲洗即可(注意不要损坏柱和管道系统); 真空脱气时防止泵油带入流动相; 用清洁的惰性塞子、搅棒、过滤器和玻璃器皿配制流动相; 已经污染的流动相一定要废弃掉。