1、液相色谱仪—气泡溢出
流动相内有气泡,关闭泵,打开泄压阀,打开purg键,清洗脱气,气泡不断从过滤器冒出,进入流动相,无论打开purge键几次,都无法清除不断产生的气泡。原因过滤器长期沉浸于乙酸铵等缓冲液内,过滤器内部由于霉菌的生长繁殖,形成菌团,阻塞了过滤器,缓冲液难以流畅地通过过滤器,空气在泵的压力作用下经过滤器进入流动相。处理过滤器浸泡于5%硝酸溶液中,超声清洗几分钟即可;亦可将过滤器浸泡于5%硝酸溶液中12~36小时,轻轻震荡几次,再将过滤器用纯水清洗几次,打开泄压阀,打开purge键清洗脱气,如仍有气泡不断从过滤器冒出,继续将过滤器浸泡于5%硝酸溶液中,如没有气泡不断从过滤器中冒出,说明过滤器内部的霉菌菌团已被硝酸破坏,流动相可以流畅地通过过滤器。打开泄压阀,打开泵,流速调至1.0~3.0ml/min,纯水冲洗过滤器1小时左右。即可将过滤器清洗干净。关闭泄压阀,纯甲醇冲洗半小时即可。
2、液相色谱仪—柱压高原因
(1)缓冲液盐分如(乙酸铵等)沉积于柱内;
(2)样品污染沉积。处理对于第一种情况先用40~50℃的纯水,低速正向冲洗柱子,待柱压逐渐下降后,相应提高流速冲洗,柱压大幅度下降后,用常温纯水冲洗,之后用纯甲醇冲洗柱子30分钟;对于第二种情况,由样品的沉积引起污染的C18柱,和纯水反向冲洗柱子,然后换成甲醇冲洗,接着用甲醇+异丙醇(4+6)冲洗柱子(冲洗时间的长短由样品污染的情况而定),再用换成甲醇冲洗,然后用纯水冲洗,最后甲醇冲洗正向冲洗柱子30分钟以上。
3、液相色谱仪—既无压力指示,又无液体流过
(1)泵密封垫圈磨损;
(2)大量气泡进入泵体。处理对于第一种情况,更换密封垫圈;对于第二种情况,在泵作用的同时,用一个50ml的玻璃针筒在泵的出口处帮助抽出空气。
4、液相色谱仪—压力波动大,流量不稳定
原因系统中有空气或者单向阀的宝石球和阀座之间夹有异物,使得两者不能密封。处理工作中注意观察流动相的量,保证不锈钢滤器沉入储液器瓶底,避免吸入空气,流动相要充分脱气。如为单向阀和阀座之间夹有异物,拆下单向阀,放入盛有丙酮的烧杯用超声波清洗。
5、液相色谱仪—出峰不佳,峰分叉
(1)色谱柱被污染;
(2)柱头填料塌陷。处理对于第一种情况,先用纯水反向冲洗柱子,然后换成甲醇冲洗,接着用甲醇+异丙醇(4+6)冲洗柱子(冲洗时间的长短由样品污染的情况而定),再换成甲醇冲洗,然后用纯水冲洗,最后甲醇冲洗正向冲洗柱子30分钟以上。如冲洗后依然出峰不佳,则考虑第二种情况。对于第二种情况,拧开柱头,检查柱填料是否硬结或塌陷。去除硬结部分(污染的填料),装入新填料,滴一滴甲醇,填料下陷,再填,用与柱内径相同的顶端平滑的不锈钢杆压紧,再填平,滴甲醇,再压紧反复几次,直至装满填平。柱头用甲醇冲洗干净,擦净柱外壁的填料,拧紧柱头,用纯甲醇冲洗30分钟以上。
6、液相色谱仪—峰面积重复性不佳
(1)进样阀漏液;
(2)加样针不到位。
(3)液量不足.
处理对于第一种情况更换进样阀垫圈;对于第二种情况保证加样针插到底,注射样品溶液后须快速、平稳地从LOAD状态转换到INJECT状态,以保证进样量的准确。日常工作中,液相色谱仪的保养非常重要,如要注意不要让空气进入输液系统和高压泵中,储液器内的溶液如长时间未用应清洗储液器并更换溶液,每次用完色谱仪后缓冲液要用纯水冲洗干净,防止无机盐析出或沉积;样品的前处理也很重要,任何样品都要尽可能地去除杂质,完全溶解,尽量减少对色谱柱的污染,以延长色谱柱的使用寿命,同时避免注射过浓的样品溶液,以免残留液在进样阀内析出固体引起堵塞;色谱柱作好标记,用于不同分析目的的色谱柱不要混用等。
输液泵/高压泵是保证HPLC系统流路畅通、流量精确和压力稳定的重要仪器部件。目前多用往复式恒流柱塞泵。主要由柱塞杆、密封垫圈和两个单项阀组成,用马达带动凸轮驱动柱塞杆作吸液和排液的往复运动。常见泵的故障主要有以下几种,并提供解决的办法。
1、单向阀故障
由于球与阀座密封不严,导致液体倒流,造成压力不稳,甚至球与阀座粘在一起阻死。为避免单项阀中的宝石球和阀座被污染,流动相应使用HPLC级的溶剂,并且配好的流动相一定要用0.45um滤膜过滤和脱气。如果泵被微粒污染,可分别用25ml水25ml甲醇25ml异丙醇25ml二氯甲烷依次冲洗,最后再用所用的溶液冲洗整个系统。注意:冲洗时应打开泄液阀。如果气泡进入阀中,它会紧贴在阀体的一侧,使宝石球难返回到阀座,引起液体倒流,导致泵的压力和流速明显改变。此时应立即打开泻液阀,大流量(2ml/min)冲洗泵,直至排除液为直线型。如果泵进气泡也可在泵头上排气泡,具体做法为:用扳手固定住进气泡的泵头,拧开输出管道的压帽,手动泵进液,这时可见到气泡从孔中挤压出来,直至无气泡排出将压帽拧紧。如果采取上述方法仍不能使压力稳定,应考虑是密封垫圈坏了?或单向阀磨损、球不光滑等,需更换部件。
2、泵垫圈故障
泵垫圈常见的故障是渗漏和垫圈受损污染系统.液相色谱系统一般情况下不要使用强酸强碱溶液,样品PH值一般调到中性,才可进样。如果强酸强碱会损坏密封垫和柱塞杆。密封圈与运动着的柱塞杆紧密接触,可使柱塞在泵头自由运动而流动相不漏出来,它是液相色谱中最易磨损的部件。有条件的实验室可三个月更换一次垫圈,以防止泵系统污染。如果用缓冲盐作流动相则更会加速垫圈的磨损,应及时冲洗。垫圈损坏一般表现为:泵压力不稳、泵头漏液。为避免上述故障的发生,我们在分析中应注意以下几点:
①使用超纯水、纯度级别较高的试剂和色谱级溶剂配制流动相;
②配好的流动相一定要抽滤脱气,即便仪器有在线脱气装置,也可以在上机前进行抽滤;
③泵在启动前一定要通过泄液阀抽净泵里的空气;
④用缓冲盐洗脱时,分析结束后一定要用水冲洗泵和整个流路系统,最后用有机溶剂充满系统。