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巴玖讲解流式细胞仪的基本结构 流式细胞仪工作原理

时间:2020-05-24    来源:仪多多仪器网    作者:仪多多商城     

流式细胞计的基本结构流式细胞计主要由四部分组成。它们是:流动室和液流系统;激光源和光学系统;光电管和检测系统;计算机和分析系统。
  (1)流动室和液流系统:流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成,常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作。设计和制作均很精细,是液流系统的心脏。样品管贮放样品,单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出;鞘液由鞘液管从四周流向喷孔,包围在样品外周后从喷嘴射出。为了保证液流是稳液,一般限制液流速度υ<10m/s。由于鞘液的作用,被检测细胞被限制在液流的轴线上。流动室上装有压电晶体,受到振荡信号可发生振动。
  (2)激光源和光学系统:经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。常用的光源有弧光灯和激光;激光器又以氩离子激光器为普遍,也有配和氪离子激光器或染料激光器。光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。汞灯是常用的弧光灯,其发射光谱大部分集中于300~400nm,很适合需要用紫外光激发的场合。氩离子激光器的发射光谱中,绿光514nm和蓝光488nm的谱线强,约占总光强的80%;氪离子激光器光谱多集中在可见光部分,以647nm较强。免疫学上使用的一些荧光染料激发光波长在550nm以上,可使用染料激光器。将有机染料做为激光器泵浦的一种成份,可使原激光器的光谱发生改变以适应需要即构成染料激光器。例如用氩离子激光器的绿光泵浦含有Rhodamine 6G水溶液的染料激光器,则可得到550~650nm连续可调的激光,尤在590nm处转换效率、高,约可占到一半。为使细胞得到均匀照射,并提高分辨率,照射到细胞上的激光光斑直径应和细胞直径相近。因此需将激光光束经透镜会聚。光斑直径d可由下式确定:d=4λf/πD。λ为激光波长;f为透镜焦距;D为激光束直径。色散棱镜用来选择激光的波长,调整反射镜的角度使调谐到所需要的波长λ。为了进一步使检测的发射荧光更强,并提高荧光讯号的信噪比,在光路中还使用了多种滤片。带阻或带通滤片是有选择性地使某一滤长区段的光线滤除或通过。例如使用525nm带通滤片只允许FITC(Fluoresceinisothiocyanate,异硫氰荧光素)发射的525nm绿光通过。长波通过二向色性反射镜只允许某一波长以上的光线通过而将此波长以下的另一特定波长的光线反射。在免疫分析中常要同时探测两种以上的波长的荧光信号,就采用二向色性反射镜,或二向色性分光器,来有效地将各种荧光分开。
  (3)光电管和检测系统:经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而进行测量的。光电倍增管(PMT)为常用。PMT的响应时间短,仅为ns数量级;光谱响应特性好,在200~900nm的光谱区,光量子产额都比较高。光电倍增管的增益从103到108可连续调节 ,因此对弱光测量十分有利。光电管运行时特别要注意稳定性问题,工作电压要十分稳定,工作电流及功率不能太大。一般功耗低于0.5W;大阳极电流在几个毫安。此外要注意对光电管进行暗适应处理,并注意良好的磁屏蔽。在使用中还要注意安装位置不同的PMT,因为光谱响应特性不同,不宜互换。也有用硅光电二极管的,它在强光下稳定性比PMT好。
  从PMT输出的电信号仍然较弱,需要经过放大后才能输入分析仪器。流式细胞计中一般备有两类放大器。一类是输出信号辐度与输入信号成线性关系,称为线性放大器。线性放大器适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物学线性过程的信号,例DNA测量等。另一类是对数放大器,输出信号和输入信号之间成常用对数关系。在免疫学测量中常使用对数放大器。因为在免疫分析时常要同时显示阴性、阳性和强阳性三个亚群,它们的荧光强度相差1~2个数量级;而且在多色免疫荧光测量中,用对数放大器采集数据易于解释。此外还有调节 便利、细胞群体分布形状不易受外界工作条件影响等优点。
  (4)计算机和分析系统:经放大后的电信号被送往计算机分析器。多道的道数是和电信号的脉冲高度相对应的,也是和光信号的强弱相关的。对应道数年纵坐标通常代表发出该信号的细胞相对数目。多道分析器出来的信号再经模-数转换器输往微机处理器编成数据文件,或存贮于计算机的硬盘和软盘上,或存于仪器内以备调用。计算机的存贮容量较大,可存贮同一细胞的6~8个参数。存贮于计算机内的数据可以在实测后脱机重现,进行数据处理和分析,后给出结果。除上述四个主要部分外,还备有电源及压缩气体等附加装置。


流式细胞仪的十大应用

  1、DNA倍体分析  DNA分析是流式细胞仪最初且是现在应用广泛检测项目。由于恶性细胞DNA含量通常与正常细胞不同,存在异倍体细胞,所以现有很研究评价异倍体细胞与肿瘤恶性度及其预后的关系。DNA含量检测还可提供细胞周期方面的信息,这在细胞生物学中运用很广泛。特别地,它可表示出细胞毒性药物对细胞作用过程。这些DNA检测还可与细胞表面标志物标记同时进行,这样在细胞混合培养中,可通常追踪表达特异标志物的细胞显示其生长周期情况。所有方法都是基于染料能与核酸起特异的化学反应并发射出荧光,常用的染料为PI,DAPI。  在该领域Partec公司的 CyFlow PA是一枝独秀。  2、细胞生存能力实验  使用Heochest 33342染料与DNA特异性结合,后因细胞活力不同染料的结合程度也各异,故可评估细胞的活性度。  3、计数外周血中检测网织红细胞  使用TO染料能够特异性地与RNA结合,结合系数高达3000,故具有很好的性价比。  4、外周血、骨髓采集物中CD34阳性干细胞计数,临床上用于骨髓移植前干细胞数理的测定。使用标准ISHAG方案,需要DNA或其他核染料占用FITC通道,PE标记CD34抗体,PE-CY5标记CD45抗体。  5、交叉淋巴细胞、粒细胞毒实验  检测识别供体血清中免疫球蛋白与受体粒细胞之间是否存在反应有着重要临床意义,因为这种反应会导致移植后发热、移植后肺损伤及免疫性粒细胞缺乏症。流式细胞仪可检测全血样本与血清孵育后粒细胞上结合的人免疫球蛋白。FITC标记人免疫球蛋白抗体、PE标记粒细胞表面标志物、PE-CY5标记HLA抗体。  6、血小板自身抗体检测  血小板自身抗体识别人血小板抗原,会引起各种临床相关症状,如新生儿自免性血小板减少症、输血后紫癜、难治性血小板减少。流式细胞可快速准确地检测血小板自身抗体。FITC标记抗人免疫球蛋白抗体、PE标记识别血小板抗体。  7、移植交叉配型  原细胞毒实验,主要用于避免移植物超急性排拆反应。流式细胞仪用于监测T或B细胞是否受到受体血清中免疫球蛋白攻击,作为HLA配型前的预实验。流式细胞仪因其高精确性已成为该领域内的金标准。FITC标记抗人免疫球蛋白抗体、PE标记识别T细胞CD3或B细胞CD29抗体。  8、检测细胞经抗原或细胞有丝分裂刺激后活化效应淋巴细胞早期活化指标CD69可用来检测免疫治疗效果。流式细胞使用三色分析可监测淋巴细胞各亚群活化情况:FITC标记的CD3抗体、PE标记的CD8抗体、PE-CY5标记的CD69抗体。  9、细胞增殖状态检测  核增殖抗PCNA、Ki67、BrdUrd用于衡量细胞增殖分裂状况,在评估肿瘤预后有重要意义。为些标志物的检测一般同细胞表面标志物同时检测。FITC标记PCNA或Ki67或BrdUrd,PE或(并)PE-CY5标记细胞表面标志物。  10、染色体分析  流式细胞仪染色分析运用两种特异性染料:Hoechest33258与核苷酸AT结合;Chromomycin A3与GC相结合。从而在双参数坐标上根据染色体ATCG含量的不同识别各种染色体。平时进行的染色体分析耗时且需要操作者极具经验,而用流式细胞仪时可快速地识别出异常染色体,如加配分选系统可将这些异常染色体分选出来作进一步分析。

标签: 流式细胞仪
流式细胞仪 流式细胞仪的十大应用_流式细胞仪

流式细胞仪的应用

  流式细胞仪在医学应用非常广泛,是一种能够对细胞进行相关处理的仪器,并且能够对细胞进行必要的分析,所以在医学生的应用非常的多。下面介绍一下流式细胞仪的具体应用:  流式细胞仪的应用  1、DNA倍体分析  DNA分析是流式细胞仪最初且是现在应用广泛检测项目。由于恶性细胞DNA含量通常与正常细胞不同,存在异倍体细胞,所以现有很研究评价异倍体细胞与肿瘤恶性度及其预后的关系。DNA含量检测还可提供细胞周期方面的信息,这在细胞生物学中运用很广泛。特别地,它可表示出细胞毒性药物对细胞作用过程。这些DNA检测还可与细胞表面标志物标记同时进行,这样在细胞混合培养中,可通常追踪表达特异标志物的细胞显示其生长周期情况。所有方法都是基于染料能与核酸起特异的化学反应并发射出荧光,常用的染料为PI,DAPI。  在该领域Partec公司的 CyFlow PA是一枝独秀。  2、细胞生存能力实验  使用Heochest 33342染料与DNA特异性结合,后因细胞活力不同染料的结合程度也各异,故可评估细胞的活性度。  3、计数外周血中检测网织红细胞  使用TO染料能够特异性地与RNA结合,结合系数高达3000,故具有很好的性价比。  4、外周血、骨髓采集物中CD34阳性干细胞计数,临床上用于骨髓移植前干细胞数理的测定。使用标准ISHAG方案,需要DNA或其他核染料占用FITC通道,PE标记CD34抗体,PE-CY5标记CD45抗体。  5、交叉淋巴细胞、粒细胞毒实验  检测识别供体血清中免疫球蛋白与受体粒细胞之间是否存在反应有着重要临床意义,因为这种反应会导致移植后发热、移植后肺损伤及免疫性粒细胞缺乏症。流式细胞仪可检测全血样本与血清孵育后粒细胞上结合的人免疫球蛋白。FITC标记人免疫球蛋白抗体、PE标记粒细胞表面标志物、PE-CY5标记HLA抗体。  6、血小板自身抗体检测  血小板自身抗体识别人血小板抗原,会引起各种临床相关症状,如新生儿自免性血小板减少症、输血后紫癜、难治性血小板减少。流式细胞可快速准确地检测血小板自身抗体。FITC标记抗人免疫球蛋白抗体、PE标记识别血小板抗体。  7、移植交叉配型  原细胞毒实验,主要用于避免移植物超急性排拆反应。流式细胞仪用于监测T或B细胞是否受到受体血清中免疫球蛋白攻击,作为HLA配型前的预实验。流式细胞仪因其高精确性已成为该领域内的金标准。FITC标记抗人免疫球蛋白抗体、PE标记识别T细胞CD3或B细胞CD29抗体。  8、检测细胞经抗原或细胞有丝分裂刺激后活化效应淋巴细胞早期活化指标CD69可用来检测免疫治疗效果。流式细胞使用三色分析可监测淋巴细胞各亚群活化情况:FITC标记的CD3抗体、PE标记的CD8抗体、PE-CY5标记的CD69抗体。  9、细胞增殖状态检测  核增殖抗PCNA、Ki67、BrdUrd用于衡量细胞增殖分裂状况,在评估肿瘤预后有重要意义。为些标志物的检测一般同细胞表面标志物同时检测。FITC标记PCNA或Ki67或BrdUrd,PE或(并)PE-CY5标记细胞表面标志物。  10、染色体分析  流式细胞仪染色分析运用两种特异性染料:Hoechest33258与核苷酸AT结合;Chromomycin A3与GC相结合。从而在双参数坐标上根据染色体ATCG含量的不同识别各种染色体。平时进行的染色体分析耗时且需要操作者极具经验,而用流式细胞仪时可快速地识别出异常染色体,如加配分选系统可将这些异常染色体分选出来作进一步分析。

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流式细胞仪 流式细胞仪的应用_流式细胞仪

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