分光光度计，又称光谱仪(spectrometer)，是将成分复杂的光，分解为光谱线的科学仪器。测量范围一般包括波长范围为380~780 nm的可见光区和波长范围为200~380 nm的紫外光区。不同的光源都有其特有的发射光谱,因此可采用不同的发光体作为仪器的光源。钨灯的发射光谱:钨灯光源所发出的380~780nm波长的光谱光通过三棱镜折射后，可得到由红、橙、黄、绿、蓝、靛、紫组成的连续色谱;该色谱可作为可见光分光光度计的光源。
光度定义
分光光度法是在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性或定量分析。常用的波长范围为:(1)200~380nm的紫外光区，(2)380~780nm的可见光区，(3)2.5~25μm(按波数计为4000cm<-1>~400cm<-1>)的红外光区。所用仪器为紫外分光光度计、可见光分光光度计(或比色计)、红外分光光度计或原子吸收分光光度计。
仪器组成
分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。
仪器主要由光源、单色器、样品室、检测器、信号处理器和显示与存储系统组成。
原理
分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光线透过测试的样品后，部分光线被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。
单色光辐射穿过被测物质溶液时，被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度(光路长度)成正比，其关系如下式:
A=-lg(I/I。)=-lgT=kLc
式中 :A 为吸光度;
I。为入射的单色光强度;
I 为透射的单色光强度;
T 为物质的透射率;
k 为摩尔吸收系数;
L 为被分析物质的光程，即比色皿的边长;
c 为物质的浓度;物质对光的选择性吸收波长，以及相应的吸收系数是该物质的物理常数。当已知某纯物质在一定条件下的吸收系数后可用同样条件将该供试品配成溶液，测定其吸收度,即可由上式计算出供试品中该物质的含量。在可见光区，除某些物质对光有吸收外，很多物质本身并没有吸收但可在一定条件下加入显色试剂或经过处理使其显色后再测定,故又称比色分析。由于显色时影响呈色深浅的因素较多，且常使用单色光纯度较差的仪器，故测定时应用标准品或对照品同时操作。
由于分光光度计是一种常用的实验室分析仪器，款式和价格都是多样化的，因此如何选择一款合适的分光光度计就显得尤为重要了。下面简单说一下如何选择分光光度计。
一、选择可满足使用者长期分析要求的仪器即可：
尽管分光光度计种类繁多，但不外乎：简易型、中档型和高档型三大类；
（1）简易型仪器及其特点：
结构：这种类型的仪器多为单光束型，即只有一束光照射到样品室内；光源一般仅有钨灯；样品支架一般为推拉式四联池架；波长选择多为手动查找，重复性差；狭缝为一个固定宽度模式；光学性能指标较低；检测器多为光敏二极管；显示器多为机械表头或数码管显示器，数据处理器一般没有。此类仪器生产以国内厂家居多。
测量模式：多为定点（固定波长）吸光度或透过率测量方式，基本不能进行波长扫描测量。
适应范围：小型实验室及示范教学，分析样品相对简单，测试结果精度要求不高。
（2）中档型仪器及其特点：
结构：此类仪器多为双光束型或准双光束型，但也有单光束仪器型；光源有钨灯和氘灯；样品池支架为两个固定式，分别是样品通道和参比通道；波长按照设定模式自动查找或扫描；狭缝多数仍为2nm固定宽度模式,也有1.5nm狭缝宽度的；检测器多数是硅光二极管，但也有少数用光电倍增管的；光学性能相对较高，其中光栅的技术指标尤为重要，较佳的光栅为凹面型，为此无论在分辨率还是在杂散光方面指标要优于简易型仪器；显示器为液晶式或连接电脑，数据处理可由仪器自身具有的或外接计算机处理。并有一定的测量附件。
测量模式：透过率、吸光度、浓度直读、单光束；单点及扫描均可。
适应范围：此类仪器基本可满足大多实验室分析需要。
（3）高档型仪器及特点：
除了中档仪器的特点外，主要是光学系统的设计和制造工艺水平更高了，比如使用了大尺寸的凹面光栅，并且光栅刻槽数大于1800条/mm；波长检测范围有的仪器在近红外区已经超过1100nm，可达到2600nm；狭缝均为连续可调型，以适应高分辨率的需要，波长扫描速度的档位也增加了，检测器均使用高灵敏度的光电倍增管和红外检测器；数据处理目前基本是电脑来执行；衡量一台仪器的另外一个指标是看此仪器是否具有丰富的附属测量器件，如偏振附件、积分球附件、反射附件、自动进样器附件、色度分析软件、薄膜附件等等。
测量模式：透过率、吸光度、浓度直读、反射方式、能量方式，单点、扫描均可；
适应范围：科研、光学产品的检测、生化样品检测、复杂样品检测等。不但可以测液态样品，也可测固态样品。
目前,紫外可见分光光度计的应用主要是在定量分析方面。先从生命科学领域的应用来介绍。紫外可见分光光度计在生命科学中应用非常广泛。最主要的是以下5个方面。
1.蛋白质分析工作中
紫外可见分光光度计在蛋白质的分析中,最主要的是作蛋白质含量检测;一般是在蛋白质的吸收峰上作吸光度测定。因为蛋白质对紫外光的主要吸收波长为280nm,所以,采用光度测量模式,将仪器的波长GOTO到蛋白质的最大吸收峰波长280nm上,测试其吸光度大小,就可完成对蛋白质的定量检测。
2.核酸分析工作中
紫外可见分光光度计在核酸分析中的应用,主要是用来对核酸的定量检测;因为核酸的吸收峰在260nm。我们只要采用光度测量模式,将紫外可见分光光度计的波长GOTO到核酸的最大吸收峰260nm上,测试其吸光度大小就是了。
3.氨基酸分析工作中
紫外可见分光光度计在氨基酸分析中的应用,主要是用来对氨基酸的定量检测。因为氨基酸对紫外光的主要吸收波长为230nm,所以,我们只要采用光度测量模式,将紫外可见分光光度计仪器的波长GOTO到氨基酸的最大吸收峰230nm上,就可测试其吸光度大小,从而计算出氨基酸的含量。但是,因为氨基酸分析时,一般是将它溶解在水中,而水在230nm附近有很多干扰吸收线,所以,在用紫外可见分光光度计对氨基酸分析检测时,要注意防止干扰的问题。此外,还需注意:只有少数氨基酸有紫外吸收,多数氨基酸无紫外吸收或很弱,测定时要衍生化后再测。
4.糖类分析测试工作中
紫外可见分光光度计在糖的分析中,主要是作定量检测。因为糖对紫外光的主要吸收波长为218nm,所以,对糖类进行分析时,只要采用光度测量模式,将紫外可见分光光度计仪器的波长GOTO到氨基酸的最大吸收峰218nm上,就可测试其吸光度大小,从而计算出糖的含量。
5.多糖分析测试工作中
紫外可见分光光度计在多糖的分析中,主要也是作定量检测。因为多糖对紫外光的主要吸收波长为206nm,所以,我们只要采用光度测量模式,将紫外可见分光光度计仪器的波长GOTO到多糖的最大吸收峰206nm上,就可测试其吸光度大小,从而计算出多糖的含量。
但是多糖的分析难度很大。因为,在206nm处的时候,光源(氘灯)的能量已经很弱,仪器光学系统的能量输出也很低,光电倍增管的灵敏度也很低,206nm左右的干扰也很大。所以,用紫外可见分光光度计作多糖的分析是很难的事,目前许多科学家正在研究中。
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