液相色谱仪是一种常用的色谱仪产品，是利用混合物在液-固或不互溶的两种液体之间分配比的差异，对混合物进行先分离，而后分析鉴定的仪器。液相色谱仪的工作原理是什么呢?
液相色谱仪的工作原理
系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱(固定相)内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来液相色谱仪主要有进样系统、输液系统、分离系统、检测系统和数据处理系统，下面将分别叙述其各自的组成与特点。
进样系统
一般采用隔膜注射进样器或高压进样间完成进样操作，进样量是恒定的。这对提高分析样品的重复性是有益的。
输液系统
该系统包括高压泵、流动相贮存器和梯度仪三部分。高压泵的一般压强为l.47～4.4X10Pa，流速可调且稳定，当高压流动相通过层析柱时，可降低样品在柱中的扩散效应，可加快其在柱中的移动速度，这对提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。流动相贮存器和梯度仪，可使流动相随固定相和样品的性质而改变，包括改变洗脱液的极性、离子强度、PH值，或改用竞争性抑制剂或变性剂等。这就可使各种物质(即使仅有一个基团的差别或是同分异构体)都能获得有效分离。
分离系统
该系统包括色谱柱、连接管和恒温器等。色谱柱一般长度为10～50cm(需要两根连用时，可在二者之间加一连接管)，内径为2～5mm，由"不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成，住内装有直径为5～10μm粒度的固定相(由基质和固定液构成).固定相中的基质是由机械强度高的树脂或硅胶构成，它们都有惰性(如硅胶表面的硅酸基因基本已除去)、多孔性(孔径可达1000?)和比表面积大的特点，加之其表面经过机械涂渍(与气相色谱中固定相的制备一样)，或者用化学法偶联各种基因(如磷酸基、季胺基、羟甲基、苯基、氨基或各种长度碳链的烷基等)或配体的有机化合物。因此，这类固定相对结构不同的物质有良好的选择性。例如，在多孔性硅胶表面偶联豌豆凝集素(PSA)后，就可以把成纤维细胞中的一种糖蛋白分离出来。
另外，固定相基质粒小，柱床极易达到均匀、致密状态，极易降低涡流扩散效应。基质粒度小，微孔浅，样品在微孔区内传质短。这些对缩小谱带宽度、提高分辨率是有益的。根据柱效理论分析，基质粒度小，塔板理论数N就越大。这也进一步证明基质粒度小，会提高分辨率的道理。
再者，液相色谱的恒温器可使温度从室温调到60C，通过改善传质速度，缩短分析时间，就可增加层析柱的效率。
液相色谱仪利用混合物在液-固或不互溶的两种液体之间分配比的差异，对混合物进行先分离，而后分析鉴定的仪器。一般问题主要有以下几种；
气泡溢出
流动相内有气泡，关闭泵，打开泄压阀，打开purg键，清洗脱气，气泡不断从过滤器冒出，进入流动相，无论打开purge键几次，都无法清除不断产生的气泡。原因过滤器长期沉浸于乙酸铵等缓冲液内,过滤器内部由于霉菌的生长繁殖，形成菌团，阻塞了过滤器，缓冲液难以流畅地通过过滤器，空气在泵的压力作用下经过滤器进入流动相。处理过滤器浸泡于5%硝酸溶液中，超声清洗几分钟即可；亦可将过滤器浸泡于5%硝酸溶液中12～36小时，轻轻震荡几次，再将过滤器用纯水清洗几次，打开泄压阀，打开purge键清洗脱气，如仍有气泡不断从过滤器冒出，继续将过滤器浸泡于5%硝酸溶液中，如没有气泡不断从过滤器中冒出，说明过滤器内部的霉菌菌团已被硝酸破坏，流动相可以流畅地通过过滤器。打开泄压阀，打开泵，流速调至1.0～3.0ml/min，纯水冲洗过滤器1小时左右。即可将过滤器清洗干净。关闭泄压阀，纯甲醇冲洗半小时即可。
柱压高
⑴缓冲液盐分如（乙酸铵等）沉积于柱内；
⑵样品污染沉积。
处理对于第一种情况先用40～50℃的纯水，低速正向冲洗柱子，待柱压逐渐下降后，相应提高流速冲洗，柱压大幅度下降后，用常温纯水冲洗，之后用纯甲醇冲洗柱子30分钟；对于第二种情况，由样品的沉积引起污染的C18柱，和纯水反向冲洗柱子，换成甲醇冲洗，接着用甲醇+异丙醇（4+6）冲洗柱子，再用换成甲醇冲洗，然后用纯水冲洗，最后甲醇冲洗正向冲洗柱子30分钟以上。
无指示
⑴泵密封垫圈磨损；
⑵大量气泡进入泵体。
处理对于第一种情况，更换密封垫圈；对于第二种情况，在泵作用的同时，用一个50ml的玻璃针筒在泵的出口处帮助抽出空气。
不稳定
原因系统中有空气或者单向阀的宝石球和阀座之间夹有异物，使得两者不能密封。处理工作中注意观察流动相的量，保证不锈钢滤器沉入储液器瓶底，避免吸入空气，流动相要充分脱气。如为单向阀和阀座之间夹有异物，拆下单向阀，放入盛有丙酮的烧杯用超声波清洗。
峰分叉
⑴色谱柱被污染；
⑵柱头填料塌陷。
处理对于第一种情况，先用纯水反向冲洗柱子，然后换成甲醇冲洗，接着用甲醇+异丙醇（4+6）冲洗柱子（冲洗时间的长短由样品污染的情况而定），再换成甲醇冲洗，然后用纯水冲洗，最后甲醇冲洗正向冲洗柱子30分钟以上。如冲洗后依然出峰不佳，则考虑第二种情况。对于第二种情况，拧开柱头，检查柱填料是否硬结或塌陷。去除硬结部分（污染的填料），装入新填料，滴一滴甲醇，填料下陷，再填，用与柱内径相同的顶端平滑的不锈钢杆压紧，再填平，滴甲醇，再压紧反复几次，直至装满填平。柱头用甲醇冲洗干净，擦净柱外壁的填料，拧紧柱头，用纯甲醇冲洗30分钟以上。
重复性差
⑴进样阀漏液；
⑵加样针不到位；
⑶液量不足。
处理对于第一种情况更换进样阀垫圈；对于第二种情况保证加样针插到底，注射样品溶液后须快速、平稳地从LOAD状态转换到INJECT状态，以保证进样量的准确。日常工作中，液相色谱仪的保养非常重要，注意不要让空气进入输液系统和高压泵中，储液器内的溶液如长时间未用应清洗储液器并更换溶液，每次用完色谱仪后缓冲液要用纯水冲洗干净，防止无机盐析出或沉积；样品的前处理也很重要，任何样品都要尽可能地去除杂质，完全溶解，尽量减少对色谱柱的污染，以延长色谱柱的使用寿命，同时避免注射过浓的样品溶液，以免残留液在进样阀内析出固体引起堵塞；色谱柱作好标记，用于不同分析目的的色谱柱不要混用等。
“堵”的表现现象就是柱压异常升高，直接原因就是流路不畅。堵塞的主要位置就是在色谱柱的前端，最主要原因就是流动相里有杂质，杂质的主要来源就是细菌。
“堵”的原因之一：配制流动相时细菌污染
首先，我们要认识到，一般的国产甲醇其实不需要额外过滤处理，直接使用没有问题。即使是有些固态微粒杂质，也能在液相流路系统最前端的过滤头上排除，真正容易引起问题的，是水中的细菌。
新制备的纯水在室内放置几天就会长菌，而这些细菌虽然肉眼不可见，却足以堵塞柱填料颗粒的空隙，造成柱子很快报废。这就是在配制流动相时造成的细菌污染的原因，解决它的方法很简单，就是确保水的可靠性。这里有两种方式推荐：
（1）较为理想的方式当然是购买实验室专用纯水机，既方便又可靠，质量也放心。唯一的缺点就是价格不菲。
（2）成箱购买市售品牌纯净水，如，500mL一支的怡宝或娃哈哈，这些水的质量足以应付液相色谱的要求。先随机抽取一支做一下细菌平板实验，待菌落数合格方可使用。这样每次只要单独开一支即可，也很方便。每次成本2元左右。
※这里特别指出一个细节：在绝大多数书本上，凡谈到配制流动相都会谈到最后有一个过滤的步骤。但是从我们长期使用的实际效果来说，只要能保证水的质量，这一步完全可以也应当去除。
原因有以下三点：
（1）流动相过滤在理论上有好处，但是，实际操作时由于不可能做到专瓶专用，反而容易造成的交叉污染，对于配比复杂的流动相影响更大。
（2）流动相过滤在经济成本上不划算。买一套过滤装置要6000多元，且过滤器公认是比较容易损坏的设备。最主要是过滤片的成本太高，一片就要几十元。按一般液相柱的正常使用寿命计算，过滤片的成本会远远高于色谱柱的成本。
（3）流动相过滤对于工作效率成本不划算。使用溶剂过滤器有一个预清洗、装备、使用、用后清洗，晾干的过程，至少也有一个小时的时间。这个成本也不能忽视。
（4）在实际工作未发现流动相不过滤会对柱寿命有任何影响。我们起码有6年时间没有做过流动相过滤的工作，但是和国内同行相比较，在同等使用强度下我们的柱寿命是比较长的。
“堵”的原因之二：使用流动相时的细菌污染。
指的是：
流动相刚开始没有长菌，在使用时却产生了细菌污染。这主要是在使用多元液相色谱仪时的一种不良使用习惯造成的。
举比较简单的例子：
50％的甲醇水流动相，有两种使用方式。一种方式是在上机前就配好混合在一起，另一种方式是在流路A放纯甲醇，流路B放纯水。
从单纯实验效果来说，后一种有明显的优点：首先是简单，不需要实验者另个计算配比混合，其次就是比例准确，能得到保留时间重复性极好的实验效果。
但是，它有一个致命的缺陷，就是纯水在流动相瓶中几天时间就会长细菌（很多情况下不仅仅用纯水作流动相，而是用缓冲盐溶液，本身就是优质肥料，细菌长得更迅速），一旦有细菌柱子就坏得很快。所以这种方式要求操作人员每次实验都要用新制备的纯水，更要求在每次实验后把水相换掉，换成甲醇冲洗干净，这一点在实际工作中很多人意识不强，就是意识到了但多次使用中总有一两次会遗漏，但是往往这一两次就足以产生致命的影响。因为液相色谱柱的堵塞是不可逆的。
所以，宁可牺牲小小的保留时间的重复性，也不要用纯水溶液作为流动相的一组。从实际实验效果来说，我建议用10％的甲醇水代替纯水溶液（以前我做过不同比例甲醇水的细菌总数实验，在5％就基本可以抑菌，在10％及以上就可以完全杀菌了），这样可以有效排除长细菌的隐患，既可作流动相，也可冲柱。就算是在配制流动相时会计算得麻烦一些，但是一次麻烦，终身受益。
“堵”的原因之三：不适当操作。
常见问题的有以下几种：
（1）在更换零件时选择的型号有误，接口不是很匹配，在拧紧的时候产生变形而使得管路堵塞。
（2）样品处理液净化得不干净，长期会在六通阀和柱之间形成阻塞不畅。
（3）在使用手动六通阀时，有些人可能由于手劲小的原因，转动的不到位，于是造成流路形成了死堵，压力快速升高超过警戒值。
（4）在使用金属管路作出废液管时，应当注意可以废液瓶中先放一些水，并把废液管的出口端放在液面下。如果位于在液相上且实验使用较高浓度的缓冲盐溶液，在停机时可能在出口端结晶成块并造成堵塞。这种情况不常见，但却的确发生过。
“堵”的原因讲了不少，现介绍查堵的方法。
在发生“堵”的现象后，就需要找出原因，主要是什么位置发生了“堵”。注意，绝大多数情况下，整个系统只会有一个地方发生堵塞。
查堵的方法是从尾向前逆向分段拆开，仔细观察压力数值，如果某一个部件（柱子除外）装上和拆下时的压力差别很大，可发展变化判断。至于柱的堵塞，可以通过换同样规格的柱的压力是否一致来判断。
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