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【流式细胞仪】流式细胞仪四个常见问题

时间:2020-06-12    来源:仪多多仪器网    作者:仪多多商城     
1.流式细胞仪日常使用规范
  【中国仪器网 使用手册】流式细胞仪是一种对细胞进行自动分析和分选的装置,依据参数测量原理工作。流式细胞仪主要由流动室和液流系统、激光源和光学系统、光电管和检测系统、计算机和分析系统4部分组成,目前在生物医疗领域有广泛运用,主要用于分析细胞表面标志、分析细胞受体、分析肿瘤细胞的DNA、RNA含量、分析免疫细胞的功能。
 
  由于流式细胞仪比较昂贵且精密,为了确保不因为使用不当就很容易使液流部位出问题。
 
  1.一般来说,需要使用的所用溶液都应该进行过滤处理,此外样本在上机前也要过滤,这么做事为了避免设备长时间使用时出现沉淀物而堵塞喷嘴;
 
  2. 开机后检测样本前,要用prime机检查喷嘴的畅通状况;
 
  3. 每日关机前移开托臂,用3~4管10%次氯酸钠反复冲洗,不要让有堵塞的喷嘴带病运行,使用经过滤处理的H2O或PBS冲洗后才关机;
 
  4. 每天要倒空废液瓶内的废液,再注入少量的次氯酸钠或消佳净溶液,以防细菌生长;
 
  5. 鞘液瓶内的液体加至4/5容量并放置一夜,防止新加入的液体有气泡产生而影响检测结果。

2.巴玖讲解流式细胞仪的基本结构

流式细胞计的基本结构流式细胞计主要由四部分组成。它们是:流动室和液流系统;激光源和光学系统;光电管和检测系统;计算机和分析系统。
  (1)流动室和液流系统:流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成,常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作。设计和制作均很精细,是液流系统的心脏。样品管贮放样品,单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出;鞘液由鞘液管从四周流向喷孔,包围在样品外周后从喷嘴射出。为了保证液流是稳液,一般限制液流速度υ<10m/s。由于鞘液的作用,被检测细胞被限制在液流的轴线上。流动室上装有压电晶体,受到振荡信号可发生振动。
  (2)激光源和光学系统:经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。常用的光源有弧光灯和激光;激光器又以氩离子激光器为普遍,也有配和氪离子激光器或染料激光器。光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。汞灯是常用的弧光灯,其发射光谱大部分集中于300~400nm,很适合需要用紫外光激发的场合。氩离子激光器的发射光谱中,绿光514nm和蓝光488nm的谱线强,约占总光强的80%;氪离子激光器光谱多集中在可见光部分,以647nm较强。免疫学上使用的一些荧光染料激发光波长在550nm以上,可使用染料激光器。将有机染料做为激光器泵浦的一种成份,可使原激光器的光谱发生改变以适应需要即构成染料激光器。例如用氩离子激光器的绿光泵浦含有Rhodamine 6G水溶液的染料激光器,则可得到550~650nm连续可调的激光,尤在590nm处转换效率、高,约可占到一半。为使细胞得到均匀照射,并提高分辨率,照射到细胞上的激光光斑直径应和细胞直径相近。因此需将激光光束经透镜会聚。光斑直径d可由下式确定:d=4λf/πD。λ为激光波长;f为透镜焦距;D为激光束直径。色散棱镜用来选择激光的波长,调整反射镜的角度使调谐到所需要的波长λ。为了进一步使检测的发射荧光更强,并提高荧光讯号的信噪比,在光路中还使用了多种滤片。带阻或带通滤片是有选择性地使某一滤长区段的光线滤除或通过。例如使用525nm带通滤片只允许FITC(Fluoresceinisothiocyanate,异硫氰荧光素)发射的525nm绿光通过。长波通过二向色性反射镜只允许某一波长以上的光线通过而将此波长以下的另一特定波长的光线反射。在免疫分析中常要同时探测两种以上的波长的荧光信号,就采用二向色性反射镜,或二向色性分光器,来有效地将各种荧光分开。
  (3)光电管和检测系统:经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而进行测量的。光电倍增管(PMT)为常用。PMT的响应时间短,仅为ns数量级;光谱响应特性好,在200~900nm的光谱区,光量子产额都比较高。光电倍增管的增益从103到108可连续调节 ,因此对弱光测量十分有利。光电管运行时特别要注意稳定性问题,工作电压要十分稳定,工作电流及功率不能太大。一般功耗低于0.5W;大阳极电流在几个毫安。此外要注意对光电管进行暗适应处理,并注意良好的磁屏蔽。在使用中还要注意安装位置不同的PMT,因为光谱响应特性不同,不宜互换。也有用硅光电二极管的,它在强光下稳定性比PMT好。
  从PMT输出的电信号仍然较弱,需要经过放大后才能输入分析仪器。流式细胞计中一般备有两类放大器。一类是输出信号辐度与输入信号成线性关系,称为线性放大器。线性放大器适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物学线性过程的信号,例DNA测量等。另一类是对数放大器,输出信号和输入信号之间成常用对数关系。在免疫学测量中常使用对数放大器。因为在免疫分析时常要同时显示阴性、阳性和强阳性三个亚群,它们的荧光强度相差1~2个数量级;而且在多色免疫荧光测量中,用对数放大器采集数据易于解释。此外还有调节 便利、细胞群体分布形状不易受外界工作条件影响等优点。
  (4)计算机和分析系统:经放大后的电信号被送往计算机分析器。多道的道数是和电信号的脉冲高度相对应的,也是和光信号的强弱相关的。对应道数年纵坐标通常代表发出该信号的细胞相对数目。多道分析器出来的信号再经模-数转换器输往微机处理器编成数据文件,或存贮于计算机的硬盘和软盘上,或存于仪器内以备调用。计算机的存贮容量较大,可存贮同一细胞的6~8个参数。存贮于计算机内的数据可以在实测后脱机重现,进行数据处理和分析,后给出结果。除上述四个主要部分外,还备有电源及压缩气体等附加装置。



3.流式细胞仪的十大应用

流式细胞仪的十大应用

  1、DNA倍体分析  DNA分析是流式细胞仪最初且是现在应用广泛检测项目。由于恶性细胞DNA含量通常与正常细胞不同,存在异倍体细胞,所以现有很研究评价异倍体细胞与肿瘤恶性度及其预后的关系。DNA含量检测还可提供细胞周期方面的信息,这在细胞生物学中运用很广泛。特别地,它可表示出细胞毒性药物对细胞作用过程。这些DNA检测还可与细胞表面标志物标记同时进行,这样在细胞混合培养中,可通常追踪表达特异标志物的细胞显示其生长周期情况。所有方法都是基于染料能与核酸起特异的化学反应并发射出荧光,常用的染料为PI,DAPI。  在该领域Partec公司的 CyFlow PA是一枝独秀。  2、细胞生存能力实验  使用Heochest 33342染料与DNA特异性结合,后因细胞活力不同染料的结合程度也各异,故可评估细胞的活性度。  3、计数外周血中检测网织红细胞  使用TO染料能够特异性地与RNA结合,结合系数高达3000,故具有很好的性价比。  4、外周血、骨髓采集物中CD34阳性干细胞计数,临床上用于骨髓移植前干细胞数理的测定。使用标准ISHAG方案,需要DNA或其他核染料占用FITC通道,PE标记CD34抗体,PE-CY5标记CD45抗体。  5、交叉淋巴细胞、粒细胞毒实验  检测识别供体血清中免疫球蛋白与受体粒细胞之间是否存在反应有着重要临床意义,因为这种反应会导致移植后发热、移植后肺损伤及免疫性粒细胞缺乏症。流式细胞仪可检测全血样本与血清孵育后粒细胞上结合的人免疫球蛋白。FITC标记人免疫球蛋白抗体、PE标记粒细胞表面标志物、PE-CY5标记HLA抗体。  6、血小板自身抗体检测  血小板自身抗体识别人血小板抗原,会引起各种临床相关症状,如新生儿自免性血小板减少症、输血后紫癜、难治性血小板减少。流式细胞可快速准确地检测血小板自身抗体。FITC标记抗人免疫球蛋白抗体、PE标记识别血小板抗体。  7、移植交叉配型  原细胞毒实验,主要用于避免移植物超急性排拆反应。流式细胞仪用于监测T或B细胞是否受到受体血清中免疫球蛋白攻击,作为HLA配型前的预实验。流式细胞仪因其高精确性已成为该领域内的金标准。FITC标记抗人免疫球蛋白抗体、PE标记识别T细胞CD3或B细胞CD29抗体。  8、检测细胞经抗原或细胞有丝分裂刺激后活化效应淋巴细胞早期活化指标CD69可用来检测免疫治疗效果。流式细胞使用三色分析可监测淋巴细胞各亚群活化情况:FITC标记的CD3抗体、PE标记的CD8抗体、PE-CY5标记的CD69抗体。  9、细胞增殖状态检测  核增殖抗PCNA、Ki67、BrdUrd用于衡量细胞增殖分裂状况,在评估肿瘤预后有重要意义。为些标志物的检测一般同细胞表面标志物同时检测。FITC标记PCNA或Ki67或BrdUrd,PE或(并)PE-CY5标记细胞表面标志物。  10、染色体分析  流式细胞仪染色分析运用两种特异性染料:Hoechest33258与核苷酸AT结合;Chromomycin A3与GC相结合。从而在双参数坐标上根据染色体ATCG含量的不同识别各种染色体。平时进行的染色体分析耗时且需要操作者极具经验,而用流式细胞仪时可快速地识别出异常染色体,如加配分选系统可将这些异常染色体分选出来作进一步分析。

流式细胞仪
流式细胞仪 流式细胞仪的十大应用_流式细胞仪
4.流式细胞仪的流动室维护和保养   流式细胞仪(Flow cytometer)是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量,并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。多数流式细胞计是一种零分辨率的仪器,它只能测量一个细胞的诸如总核酸量,总蛋白量等指标,而不能鉴别和测出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。也就是说,它的细节分辨率为零。
  
  了解如何正确地维护和保养流动室,可zui大化延长流动室的性能和使用期限。而不正确的使用和维护,则可能产生不正确的读数和数据,而且会使得你不停呼叫工程师甚至更换流动室或光路。
  
  一、需避免的化学物质
  
  目前大部分流动室都是由石英或熔融石英制作而成,故需避免pH值大于9.5的碱性溶液非常重要。这些溶液可能腐蚀石英,使其变毛糙,影响光学性能。一旦使用过碱性溶液,在流动室的通路上可能会看到一些被腐蚀的条纹,如果这些条纹刚好位于激光器检测点,那么就可能影响检测准确性。
  
  二、如何避免结晶
  
  避免结晶很重要。为了避免流动室内液体结晶,需经常用水冲洗。在跑完缓冲液或生理盐水之后,尤其是高pH值的溶液后,彻底冲洗十分必要。有些流动室内部会包被一些特殊材料,以防止真菌或结晶生长。
  
  三、清洗
  
  清洗流动室和光路连接器对于任何流式细胞仪的正确运行都十分重要。其中zui重要的一点就是别让流动室的液体干掉,而含有盐分、蛋白或其它固态溶解物的液体,均可能损伤液路。
  
  的清洁方式就是用充满10%表面活性剂的针头连接流动室,将活性剂注入流动室,多次注射后,将液体留在流动室内至少2小时。zui后关机前,流动室必须完全用蒸馏水充满。
  
  如果流动室只是过夜,第二天马上就用,那么可以用buffer充。
  
  如果要过一个周末或长时间不用,那么建议使用蒸馏水或20%乙醇充。
  
  四、操作和使用中的注意事项
  
  1.光电倍增管要求稳定的工作条件,暴露的较强的光线下以后,需要较长时间的“暗适应”以消除或降低部分暗电流本底才能工作;另外还要注意磁屏蔽;
  
  2.光源不得在短时间内(一般要1h左右)关上又打开;使用光源必须预热并注意冷却系统工作是否正常;
  
  3.液流系统必需随时保持液流畅通,避免气泡栓塞,所使用的鞘流液使用前要经过过滤、消毒;
  
  4.注意根据测量对象的变换选用合适的滤片系统、放大器的类型等;
  
  5.特别强度每次测量都需要对照组。



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